论文总字数：27847字

摘 要

N-糖基化修饰是毕赤酵母中最常见的一种蛋白翻译后修饰，有70-90％的N-糖基化修饰位点（Asn-Xaa-Ser/Thr）被修饰。这种修饰对蛋白在内质网中的折叠和高尔基体的转运是至关重要的，最终影响蛋白的表达水平。序列Asn-Xaa-Thr比Asn-Xaa-Ser的N-糖基化修饰效率要高，因此，对蛋白的表达具有不同的影响。本论文研究在弹性蛋白酶的N36、N43、N212、N264和N280位点这两者不同的N-糖基化修饰位点类型对其表达水平的影响。结果表明在N212和 N280位点，将Asn-Xaa-Thr替代 Asn-Xaa-Ser后，分别提高了弹性蛋白酶表达水平43％和25％。

关键词：N-糖基化，定点突变，弹性蛋白酶，毕赤酵母

Abstract: N-glycosylation is one of the most common forms of protein post-translational modification in P. pastoris ; approximately 70‒90% of the asparagine (Asn, N) residues in potential N-glycosylation sites (Asn-Xaa-Ser/Thr) are N-glycosylated. The critical role of N-glycosylation in protein folding and trafficking through the ER and Golgi is well known. The N-glycosylation efficiency of Asn-Xaa-Thr exceeds that of Asn-Xaa-Ser; in fact, the former sequon is reported to be glycosylated two to three times more often than the latter sequon. The two forms of the N-glycosylation site in proteins may have differential effects on expression. The objective of this paper was to study the effect of substituting Thr for Ser in the N-glycosylation sequons (N36, N43, N212, N264 and N280) of rPAE on expression of the protein in P. pastoris. Our results indicated that the substitution of Asn-Xaa-Thr for Asn-Xaa-Ser at N212 and N280 increased the recombinant Pseudomonas aeruginosa elastase production by 43% and 25%, respectively.

Key words: N-glycosylation, Site-directed mutagenesis, Pseudomonas aeruginosa elastase, Pichia pastoris

目 录

引言： 5

1 实验材料及仪器 9

1.1 酶、菌株与质粒 9

1.2 试剂与溶液 9

1.3 实验仪器 9

2 实验方法 10

2.1 定点突变 11

2.2 目的基因的亚克隆 11

3 实验流程 12

3.1 基因定点突变 12

3.1.1 引物设计 12

3.1.2 原突变位点附近基因序列 12

3.1.3 引物序列 13

3.1.4 聚合酶链式反应 14

3.1.5 琼脂糖凝胶电泳 14

3.2 感受态制备和目的基因的转化 15

3.2.1 大肠杆菌感受态制备 15

3.2.2 目的基因的转化 15

3.2.3 提取质粒并测序 15

3.3 目的基因的亚克隆 15

3.3.1 乙醇沉淀DNA 15

3.3.2 酶切 16

3.3.3 目的基因的连接 16

3.3.4 再次转化筛选 16

3.4 诱导产酶 16

3.4.1 毕赤酵母电转化方法 16

3.4.2 菌体的准备 16

3.4.3 电击转化 16

3.4.4 诱导产酶培养 17

3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳 17

3.5.1 染色和脱色 17

3.6 弹性蛋白酶酶活力的测定 17

4 结果与讨论 18

4.1 突变蛋白的N-糖基化修饰水平 18

4.2 N-糖基化修饰位点类型的改变对表达量的影响 19

结论 21

参考文献 22

致 谢 26

附 录:作者在本科期间发表的论文清单 27

引言：

1.弹性蛋白酶简介

铜绿假单胞菌弹性蛋白酶（EC 3.4.24.26），中文简称弹性蛋白酶，其英文术语为Pseudomonas aeruginosa elastase（简称PAE）。该蛋白酶属于蛋白酶M4家族，即嗜热菌蛋白酶家族（thermolysin family）。它是由铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）产生的一种用来水解不溶性弹性蛋白为主要特性的锌金属蛋白酶^[1-4]。

铜绿假单胞菌弹性蛋白酶是通过lasB基因表达，该基因的编码区全长1497bp,编码的为53.7kDa分子量的多肽（498个氨基酸残基，prepropseudolysin），其中1-23位氨基酸残基多肽为分子量2.4kDa的信号肽（signal peptide），24-197位氨基酸残基多肽为分子量18.2kDa的前导肽（propeptide），最后198-498位氨基酸残基多肽为分子量33.1 kDa的成熟蛋白酶（mature protease）^[1,2,5]。未剪切前的信号肽、前导肽以及成熟蛋白酶的多肽称为前弹性蛋白酶原（prepropseudolysin），其中在未自我剪切成熟前的前导肽和成熟蛋白酶多肽称为弹性蛋白酶原（propseudolysin）。

弹性蛋白酶的分子量为33.1kDa，等电点为5.88，其适宜温度为60℃，在不高于60℃条件下很稳定，最适宜pH为8.0，在pH5.0-10.0条件下稳定^[6,7]。该蛋白酶能高效水解以Leu或Phe等疏水氨基酸残基为羧基端的肽键，另外该酶具有较为广泛的蛋白底物降解范围，其中酪蛋白、卵白蛋白、胶原蛋白、牛血清白蛋白、明胶都能被其降解^[8,9]。

弹性蛋白酶在实际生活生产中有很高的应用价值，尤其在降解羽毛蛋白资源、食品深加工以及在有机溶剂中催化合成肽方面发挥着良好作用^[15,16]。在降解羽毛方面：90%的羽毛是蛋白质，其中主要是β-角蛋白，由二硫键、氢键和疏水键高度交联形成的纤维化而不可溶的一种结构^[10-12]。因为它的结构致密性，羽毛角蛋白化学性质结构稳定，不会被正常常见的蛋白酶，比如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等水解^[11,13]。全球家禽养殖业每年产生超过5亿吨的废弃羽毛对环境造成了一定的危害^[14]。而由铜绿假单胞菌产生的弹性蛋白酶（也有文献称其为角蛋白酶）具有良好的降解羽毛蛋白的能力^[15]；在农副产品深加工领域：弹性蛋白酶能够水解动物组织中一些难以处理的蛋白，还能有效的降解结缔组织中坚韧的弹性纤维部分达到嫩化肉质但不改变原有风味的效果，可以在食品工业中作为优秀的肉类嫩化剂^[17]；在有机溶剂中催化合成肽方面：有机溶剂能够改变蛋白酶催化反应的平衡，可导致肽的合成而且还改变了酶的底物特异性。这些特性为合成多肽提供了新的方法^[18]。利用蛋白酶在有机溶剂中催化多肽的合成这项技术有许多优势也有限制因素（酶在有机溶剂中的稳定性普遍不高，而且酶的活性与在水相中相比也要差），因此，获得在有机溶剂中稳定且活性好的蛋白酶是这项技术的关键^[19,20]。

2.弹性蛋白酶基因的异源表达

P. aeruginosa是一种能引起动物包括人类疾病的常见微生物，广泛分布于水源、土壤、皮肤和大多数环境中。该微生物能广泛的利用多种有机物，可以感染破损的组织，引起炎症甚至是败血症，如果在人体关键的部位，例如肺、泌尿系统和肾脏造成病变，会引起致命性的结果^[23-26]。因此，如果要将由这种条件致病菌分泌的弹性蛋白酶安全地应用在工业化领域上，必须将弹性蛋白酶基因（lasB）在安全宿主中表达。

2.1在大肠杆菌中表达

Robert A. Bever等人将P. aeruginosa PAO1的弹性蛋白酶基因（lasB）构建到了质粒pUC18，并在大肠杆菌中表达。结果表明lasB基因的启动子和翻译起始因子在大肠杆菌中能发挥作用，由大肠杆菌表达的重组弹性蛋白酶与天然酶具有相似的分子量^[1]。Hiroyasu Ogino等人将P. aeruginosa PST-01的弹性蛋白酶基因在大肠杆菌中成功地表达，基因表达产物没有分泌到胞外，重组弹性蛋白酶原在细胞溶解后释放，自我水解形成成熟弹性蛋白酶（分子量为33.1kDa）。在有机溶剂中，重组蛋白酶与其天然野生蛋白酶同样具备良好的稳定性^[27]。Lin Hsin-Hung等人将lasB基因利用表达载体pET-43b( )在大肠杆菌 AD494(DE3) pLysS中表达，得到了可溶的重组酶蛋白。重组酶蛋白经过镍柱纯化达到了电泳纯，重组酶的酶学性质与天然酶相似^[28]。

2.2在毕赤酵母中表达

毕赤酵母是一种能够成功表达异源蛋白宿主，具有基因操作的便利性、能达到较高的细胞密度、能在廉价培养基上快速生长、具有翻译后修饰的能力等优点。另外，毕赤酵母具有公认的生物安全性，在表达异源蛋白过程中不产生内毒素和病毒^[29-31]。因此，选择将lasB基因在毕赤酵母上表达是合适的。Lin Xijin等人将lasB全长基因插入到pPIC3.5K表达载体上，使lasB基因在毕赤酵母KM71上成功表达^[32]。载体pPIC3.5K没有编码信号肽碱基序列，在lasB基因表达的信号肽引导下，重组弹性蛋白酶能分泌到毕赤酵母胞外，这说明lasB基因编码的信号肽能有效地被毕赤酵母识别并发挥作用。重组弹性蛋白酶经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，其分子量大概为34kDa；在发酵上清液中，重组酶的浓度达到了450mg·L-1，酶活力是原产酶菌株P. aeruginosa的2.6倍^[32]。

3. N-糖基化对毕赤酵母表达重组酶的影响

在自然界，被糖基化修饰的蛋白超过半数，其中大约四分之三的糖基化修饰是N-连接的糖基化修饰^[33]。N-糖基化是蛋白翻译后修饰最常见也是最复杂的一种，这种修饰与蛋白的折叠、分泌、胞内运输及细胞通讯有着密切关系^[34]。在蛋白氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr（Asn为天冬酰胺、Xaa是除了Pro的任意氨基酸、Ser为丝氨酸、Thr为苏氨酸）中70-90%的Asn残基是被糖基化修饰的。依据不同的合成过程N-连接的糖链能够分成三类，即为高甘露糖型、复杂性和杂合型^[35]。在毕赤酵母中N-糖基化的修饰类型是高甘露糖型（High mannose），85%的N-连接糖链具有GlcNAc2Man8-14（GlcNAc表示N-乙酰葡糖胺，Man表示甘露糖）结构^[35]，而GlcNAc2Man9是毕赤酵母细胞中蛋白N-糖基化修饰最典型的糖链结构，其分子量是1884Da^[36]。大量的文献报道了N-糖基化修饰对糖蛋白结构和功能的调节作用。一般说来，N-糖基化修饰对酶的稳定性、活性、底物的特异性和表达水平有着重要的影响。

4. N-糖基化对蛋白表达的影响

N-糖基化修饰对于蛋白的折叠及通过内质网和高尔基体的转运有着重要的作用^[37]。利用定点突变技术去除糖蛋白的N-糖基化位点的研究发现，在大多数情况下去除N-糖基化会显著地抑制蛋白的分泌^[34]，但也有文献报道去除N-糖基化修饰对蛋白的分泌影响很小^[38,39-41]。即使在具有多拷贝目的基因菌株中目的基因转录水平较高，但如果表达的重组蛋白不能正确折叠，则只会停留在光面内质网，而不能成功分泌到胞外，故在内质网中蛋白的正确折叠是重组蛋白的分泌的重要条件之一^[34]。蛋白合成初期的新生肽链的N-糖基化对于蛋白的正确折叠有着重要的功用，非正确折叠的新生肽会经过内质网关联降解过程（ER-associated degradation）被泛素缀合酶降解，最终被细胞质中的蛋白酶体彻底消化^[42]。

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