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摘 要

： 以小麦为试材，用硝酸将Hongland培养液的pH值调至3.0。当小麦种子催芽发芽后，用pH值为3.0的Hongland培养液喷施，这样处理一周。一周后首先测量小麦的生理指标，包括叶绿素的含量、胚根长度。生理指标测量完后，将幼苗种子中的蛋白质提取出来，通过多种技术手段分离并鉴别差异表达的蛋白（与对照组比较所产生的差异）。最后通过蛋白表达的差异以及蛋白质的功能来推断低pH环境给小麦种子萌发所带来的影响。

关键词：小麦，低pH，蛋白差异表达，双向凝胶电泳，蛋白质鉴定

Abstract：With wheat as test materials, nitric acid adjusts the pH value of Hongland nutrient solution to 3.0. After wheat seeds sprouting, spraying with pH value of 3.0 Hongland broth for a week. A week later, physiological index should be measured, including the content of chlorophyll, radicle length. Then proteins are extracted from the seed seedlings, through a variety of technical means of separation and identification of differentially expressed proteins ( compared with control group ).

Finally the influence of low pH on seed germination of Wheat will be infered

according to differences in proteins expression and the function of proteins.

Keywords： Wheat, Low pH, Differentially expressed proteins,

Two dimensional gel electrophoresis, Protein identification

目录

前言 6

1 材料与方法 6

1.1 实验材料 6

1.1.1主要仪器设备 6

1.1.2主要试剂 7

1.2 实验方法： 7

1.2.1 胚根长度测定 7

1.2.2 叶绿素含量测定 7

1.2.3蛋白质双向电泳： 7

1.2.4 蛋白质凝胶扫描及图像分析 9

1.2.5 样品MALDI-TOF质谱分析 10

1.2.6蛋白质鉴定及数据库检索 10

2 结果与分析 11

2.1 低pH值对小麦生长的影响 11

2.1.1 低pH值对小麦生长叶绿素含量的影响 11

2.1.2 低pH值对小麦生长胚根长的影响 11

2.2 低pH值对小麦种子萌发过程中差异表达蛋白质的影响分析 12

2.2.1 低pH条件使小麦萌发过程中差异表达全蛋白质图谱的建立与整体分析 12

2.2.2 低pH条件使小麦萌发过程中差异表达全蛋白质中的部分蛋白质的放大点三维图 13

2.2.3 差异表达蛋白质的种类辨别和功能归类 13

讨论 16

参考文献 19

前言

在现代工业高速发展创造价值的同时，也带来了一系列问题，酸雨就是其中之一。酸雨对生态环境的影响已经引起人们的广泛重视^[1][2]。由于许多农作区受到酸雨的危害，因此酸雨对农作物的影响肯定将是一个大家所关心的问题。正常的雨水呈现弱酸性，这是由空气中的CO₂ 溶解在水中，形成碳酸（H₂CO₃）引起的，pH值约为5.5。由于大量工业污染物(如SO₂ 、NO₂ 等)被排放到空气中，遇水形成强酸。强酸使雨水的pH值急剧下降，形成酸雨。过酸的环境不利于作物的生长。许多作物在土壤pH值6.0—7.0范围内生长最好，过酸的土壤环境不利于作物根系的生长和对肥料的吸收^[3]。酸雨不仅引起农作物根和叶片的伤害，也可以造成土壤酸化^[2]。土壤酸化会形成酸性淋溶，使土壤中的有效养分如钾、镁、钙、硼、锌等从表层土壤中淋失掉，造成表层土壤缺素和贫瘠化，铝和锰元素富集毒害作物^[3]。国内外在研究酸雨对农作物的影响时，主要集中在酸雨对农作物根、叶片的伤害及产量的影响上^[2]。而从酸雨对农作物种子萌发时蛋白表达的影响方面研究和报道甚少。为此，本文利用硝酸模拟酸雨使土壤酸化，来研究低pH值对小麦种子发芽及幼苗早期生长的影响，并从蛋白质水平上分析探讨酸雨对农作物生长的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选择籽取饱满的小麦种子, 用纱布包好, （75%乙醇灭菌30 s，无菌水冲洗3遍，10%次氯酸钠消毒10 min，无菌水冲洗6遍之后取出置于垫有双层滤纸的大号培养皿中, 在30±1℃恒温下催芽。每个处理30粒种子，均匀铺于纸床上，4次重复。发芽1周后，开始酸化处理，对照组用正常Hongland培养液喷施，保持纸床湿润，处理组将Hongland培养液用HNO₃调节pH到3.0喷施，处理1周后测量相关生理，并取样液氮速冻后，-70度冰箱保存用作蛋白提取。

1.1.1主要仪器设备

等电聚焦仪、电泳槽、 Ettan^TMDALT Six electrophoresis unit（24cm，Amersham Bioscience）、真空干燥仪、电泳仪、离心机 、真空离心浓缩仪、扫描仪、质谱仪。

1.1.2主要试剂

CHAPS、甲叉双丙烯酰胺、硫脲、琼脂糖、碘乙酰胺、尿素、碳酸氢铵、乙腈、丙烯酰胺acrylamide、DTT、SDS、IPG buffer pH3-10、Sequencing Grade Modified Trypsin。

1.2 实验方法：

1.2.1 胚根长度测定

随机选取纸床发芽幼苗10颗，测定胚根长度，每个处理至少重复5次，取平均值。

1.2.2 叶绿素含量测定

参照苏正淑等^[4]的方法。首先取鲜嫩小麦叶片0.25 g，蒸馏水冲洗干净。然后将小麦植株叶片磨成均匀液浆后放于20 ml的离心管内，随后加入10 ml乙醇和丙酮的混合液，暗处浸泡处理至少24 h；在浸泡处理过程中应该每隔6 小时振荡一次，直到叶片从绿色变成白色为止。再将叶绿素提取液倒入光径为1 cm的比色皿内，空白对照组为80%的丙酮，在波长分别为663 nm、645 nm、440 nm下测定吸光度A₆₆₃、A₆₄₅和A₄₄₀。

叶绿素的含量(mg/g)＝（叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品鲜重

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