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摘 要

本实验以黄瓜叶片为实验材料，以叶绿素提取液中丙酮与乙醇的混合比例、提取温度和提取时间为考察因素，以叶绿素的提取率为考察指标，采用正交实验对叶绿素的浸提条件进行了优化。实验结果表明，在实验影响因素中，影响程度从大到小依次为提取液中丙酮与乙醇的混合比例＞反应温度＞提取时间。其中，以丙酮、乙醇的混合比例为2:1、浸提温度为60℃、浸提时间为10min时，叶绿素提取效率最佳，而且稳定性较好。

关键词: 黄瓜叶片，叶绿素含量，提取条件，正交实验

Abstract: In this paper, using cucumber leaf as experimental material, the orthogonal experiment was designed with extraction rate of chlorophyll as markers, and with the mix proportion of acetone and ethanol in chlorophyll extract, extraction temperature and extraction time as factors to optimize the extraction process of chlorophyll. The experimental results show that the influence factors of the experiment, influence degree from big to small in turn to the mix proportion of acetone and ethanol in chlorophyll extract gt; extraction temperature gt; extraction time. With the mix proportion of acetone and ethanol in chlorophyll extract is 2:1, leaching temperature of 60℃, leaching time is 10 min, the material have higher extraction rate and good stability.

Keywords: cucumber leaf, chlorophyll concentration, extraction conditions, orthogonal experiment

目 录

1 前言 4

1.1 叶绿素测定方法比较 4

1.2 实验依据和突破 5

2 材料和方法 6

2.1 材料、试剂与仪器 6

2.2 实验方法 6

2.2.1 正交设计 6

2.2.2 黄瓜幼苗的培养 6

2.2.3 叶绿素的浸提 6

2.2.4 叶绿素稳定性检验 7

3 结果与分析 8

3.1 叶绿素最佳提取条件的优化 8

3.2 叶绿素稳定性比较 9

结 论 10

参考文献 12

致 谢 13

1 前言

叶绿素作为植物生长发育的重要生理指标之一，它的含量与植物营养状况、光合速率都具有较为密切的关系。在科学研究中，叶绿素含量往往是用来判断植物的生长状况的标准之一。在农业生产中，农民常常把叶片变化作为看苗诊断和肥水管理的重要指标。植物叶片叶绿素含量的快速、准确检测，对农作物的营养诊断与施肥、长势检测与估产等方面具有非常重要的意义。长期以来，植物叶绿素的测定多采用Arnon法^[1]，由于Arnon 法中，研磨和去渣两个操作环节较为麻烦，工作量也较大，给大量样品测定带来较大困难。1979年，J.D.Hiscox等提出了DMSO法^[2]，虽然DMSO法解决了Arnon法繁琐的问题，但DMSO具有较大的粘性，气味难闻，对人的眼睛具有一定的刺激作用，而且在低于19℃的环境中极易结晶，而且受温度的影响也比较大。之后，陈福明进一步研究了混合液法^[3]，混合液法快速、简便，不但克服了Arnon法的研磨、过滤或离心的烦琐步骤，而且浸提法获得的叶绿素也具有比较好的稳定性，其浸提液的叶绿素吸收光谱又与丙酮提取液叶绿素吸收光谱相似，吸收高峰与Arnon法完全相符，因此，可利用Arnon法的计算公式来计算叶绿素含量，但易受多酚类化合物的干扰而影响其准确性。张宪政在其基础上进行改良，研究了丙酮与乙醇混合液提取法^[4]，研究显示，其稳定性高于丙酮、乙醇、水混合液法。但提取时间较长，不利于叶绿素的大批量、快速提取和检测。我们课题组在张宪政的丙酮乙醇混合液法和冯瑞云的热醇快速提取法^[5]的基础上，在实践中摸索出了一种稳定高效的混合液加热浸提法，同时，利用正交设计对丙酮乙醇的混合比例、反应温度和处理时间等提取条件进行了优化。

1.1 叶绿素测定方法比较

植物叶绿素含量的测定通常有分光光度计法、活体叶绿素仪法和光声光谱法三种方法。其中，分光光度计法应用最为广泛。由于所用的叶绿素提取溶剂不同，分光光度计法又分为多种测定方法。以下为常用的几种分光光度计法。

a、Arnon法：1949年经Arnon解释和推导以来，Arnon法就因不复杂易掌握而在国际上被广泛应用至今。根据Arnon法，叶绿素a，b及总含量（mgL^-1）的计算方法为：

C_a=12.7A₆₆₃-2.69A₆₄₅

C_b=22.9A₆₄₅-4.68A₆₆₃

C=C_a C_b=20.2A₆₄₅ 8.02A₆₆₃

但是，因为要在易于挥发的丙酮中研磨植物材料，且得到的提取液还要离心或过滤，这对于需要测定较多样品的实验就显得既繁琐又复杂，同时由于叶绿素在80%的丙酮溶液中易受光氧化破坏，常会获得偏低的测定值，在对大量样品进行测定时，则更容易造成误差。这就在一定程度上限制了这个方法的使用。

b、DMSO法：1979年Hiscox等报道了DMSO法^[2]，用二甲基亚矾（DMSO）作为浸提液提取高等植物的叶绿素，省去繁琐和极费时间的研磨和离心的程序，大大简化了测定手续。实验还证明，叶绿素在DMSO溶液中比在丙酮溶液中具有更高的稳定性，这对于有大量样品需要测定的工作来说是十分有利的。但是由于DMSO法是在65℃高温下提取，叶绿素提取液与丙酮叶绿素提取液的吸收光谱存在一定的差异，用丙酮法公式计算叶绿素含量不适用。而且DMSO的气味难闻并且在温度低于19℃时易结晶，致使该法的应用受到一定的限制。

c、丙酮乙醇水混合液法：该法是用丙酮、乙醇和蒸馏水按4.5:4.5:1的比例配成混合液，将剪成细丝的植物材料浸泡于40℃的黑暗条件下的此混合液中，按Arnon法公式计算叶绿素含量^[3]。但这种方法的提取时间长，提取液极易受光氧化破坏而使测定值不够稳定。

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