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摘 要

达托霉素（A21978C₀）是一种在医学应用上优势显著的新型环脂肽类抗生素，但因其产量较低而限制了进一步生产开发。因此，本实验对达托霉素发酵培养基进行优化，以提高其发酵产量。首先，通过单因素实验法获得了最佳碳源、氮源以及其浓度：最佳碳源为糊精和蔗糖，最佳氮源为大豆蛋白胨，其浓度分别为37.5g/L、36g/L、16.7g/L。在此基础上继续进行糊精、蔗糖、大豆蛋白胨三因素的正交试验设计，实验结果为：糊精的最佳浓度为37.5g/L，蔗糖的最佳浓度为48g/L，大豆蛋白胨最佳浓度为25g/L。在此条件下进行发酵，测得的达托霉素峰面积为399856mAU*min，是未优化前峰面积（170931mAU*min）的2.3倍。通过本实验的研究，为达托霉素的进一步生产开发提供了一定的技术支持。

关键词：达托霉素；玫瑰孢链霉菌；发酵培养基；优化；正交试验设计

Abstract: Daptomycin (A21978C₀) is a novel cyclolipopeptide antibiotic with significant clinical advantages. However, due to its low yield, it limits the further development of production. Therefore, in this experiment, daptomycin fermentation medium was optimized to increase its fermentation yield. First, single-factor experiments were used to determine the optimal carbon source, nitrogen source, and its concentration: the best carbon source was dextrin and sucrose, and the bestd nitrogen source was soybean peptone, with concentrations of 37.5 g/L, 36 g/L and 16.7g/L respectively. On this basis, the orthogonal test design of dextrin, sucrose and soy peptone was continued. The experimental results showed that the optimum concentration of dextrin was 37.5 g/L, the optimal concentration of sucrose was 48 g/L and the optimal concentration of soy peptone is 25g/L. Fermentation was carried out under this medium conditions and the peak area measured was 399856 mAU*min, it was 2.3 times of the peak area (170,931 mAU*min) that before optimization. Through the research of this experiment, it provides some technical support for the further development of daptomycin production.

Keywords: Daptomycin; Streptomyces roseosporus; Fermentation medium; Optimization; Orthogonal experimental design

目录

1.前言 7

1.1 达托霉素简介 7

1.2达托霉素菌株的生长形态 8

1.3达托霉素理化特性 8

1.4达托霉素作用机制 9

1.5达托霉素的应用 9

1.6达托霉素研究发展史 9

1.7研究思路 10

2.材料与方法 11

2.1材料 11

2.1.1菌种 11

2.1.2试剂 11

2.1.3培养基 12

2.1.4仪器设备 12

2.2方法 13

2.2.1菌种保藏法 13

2.2.2种子的培养方法 13

2.2.3发酵的培养方法 13

2.2.4单因素实验法 13

2.2.5达托霉素产量测定方法——高效液相色谱法 15

2.2.5正交试验法 15

3.结果与分析 17

3.1碳源种类及浓度对达托霉素发酵产量的影响 17

3.1.1碳源种类对达托霉素发酵产量的影响 17

3.1.2碳源浓度对达托霉素发酵产量的影响 18

3.2氮源种类及浓度对达托霉素发酵产量的影响 19

3.2.1氮源种类对达托霉素发酵产量的影响 19

3.2.2氮源浓度对达托霉素发酵产量的影响 20

3.3正交法测定最佳优化方案 21

4．结论与展望 23

4.1结论 23

4.2展望 23

5. 致谢 24

参考文献 25

1.前言

1.1 达托霉素简介

达托霉素（A21978C₀）是由玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)在发酵过程中产生的一种次级代谢产物。它对革兰氏阳性菌有很强的抑制作用作用,由于其临床效果好，所以被评为继“抗生素最后一道防线”万古霉素后发现的一种新型抗生素^[1-2]。玫瑰孢链霉菌产物的主要成分除达托霉素以外，还包括A21978C₁-C₃，见图1。虽然其产物中组分的成分结够比较相似，但是其临床应用效果却远低于达托霉素。据相关研究表明，玫瑰孢链霉菌的发酵产物的抑菌活性与碳链数目有关，碳链数目越多其抑菌活性也越强，但同时细胞毒性也增加。达托霉素与其同系物相比碳链数目较少，所以它作为抗生素的治疗指数最高,效果也较为显著^[3]。

目前，国外达托霉素发酵单位已接近2g/L^[4], 产量相对较高，而国内对这方面的研究却不尽如人意,在这一课题上仍有很大的探索研究空间。针对这一现状，国内相关单位已经开展了部分研究，但是由于实验材料、实验环境、现有水平等各因素的影响，目前为止还未确定最佳的提高达托霉素产量的方案。所以，当前我国对于达托霉素的研究还处于探索阶段。

1.2达托霉素菌株的生长形态

(1)菌体在试管斜面中的生长形态

玫瑰孢链霉菌在试管斜面中生长时，菌体颜色呈现为白色，多为颗粒状突起，菌体之间分界不明显，成熟之后分泌相关色素，使得培养基颜色变为深红色，同时这也是鉴定本菌株的重要凭证^[5-6]。玫瑰孢链霉菌在生长时与培养基结合紧密，不容易从培养基中挑起。所以，在接种至种子培养基时，经常使用挖块法将培养基整块挑起，直接接种至种子培养基中。

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