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摘 要

Ezrin是ERM蛋白家族的成员，参与细胞骨架的组成、信号通路的传导等生理过程。本研究对Ezrin进行了原核及真核表达，在此基础上，对其磷酸化功能进行了初步研究。结果表明，Ezrin与PKM2、ACAP4之间存在明显的相互作用。荧光免疫结果显示，在西咪替丁处理条件下，Ezrin定位在细胞底膜，组胺活化壁细胞到最大刺激期时，Ezrin定位于顶膜的囊泡上。推测Ezrin的磷酸化可能受Ezrin和ACAP4、PKM2相互作用的调控，进而影响和改变细胞的动力学特性。

关键词：Ezrin蛋白, PKM2, ACAP4,磷酸化

Abstract：Ezrin is a member of ERM protein family, which involved in many physiological process such as the composition of the cytoskeleton, transmission of signaling pathways. On this basis of prokaryotic expression and eukaryotic expression, the preliminarily reseach on phosphorylation of Ezrin protein in this paper. The results show that the existence of the interaction between Ezrin, PKM2 and ACAP4. The results of fluorescence immunoassay revealed that Ezrin located at the end of cell membrane. Nevertheless, Ezrin located at on the roof membrane vesicles, when the cell in the biggest stimulus period, under the activation of histamine. It is speculated that the phosphorylation of Ezrin protein was regulated by the interaction between Ezrin, PKM2 and ACAP4. And then, the interaction would influence and change the dynamic characteristic of cell.

Keywords：Ezrin, PKM2, ACAP4, phosphorylation

目 录

1 Ezrin蛋白 7

1.1 Ezrin蛋白的生物学特性 7

1.1.1 Ezrin蛋白的分布 7

1.1.2 Ezrin蛋白的结构 7

1.1.3 Ezrin蛋白的表达 7

1.2 Ezrin 蛋白的生物学功能 8

1.2.1 Ezrin蛋白与信号传导 8

1.2.2 Ezrin蛋白与细胞凋亡 9

1.2.3 Ezrin蛋白与细胞迁移 9

1.2.4 Ezrin蛋白与粘附分子 9

1.2.5 Ezrin蛋白与细胞周期 10

1.3 Ezrin蛋白与肿瘤 10

1.3.1 Ezrin蛋白与肿瘤转移相关分子 10

1.3.2 Ezrin参与肿瘤的发生与迁移 10

1.4 翻译后修饰对Ezrin功能潜在的影响 11

2. 实验材料与方法 11

2.1 主要材料 11

2.1.1 载体 11

2.1.2 质粒 11

2.1.3 细胞株与菌株 11

2.2 试剂 11

2.2.1 蛋白质相互作用相关实验试剂 11

2.2.2 细胞培养相关实验试剂 11

2.2.3 细胞处理相关实验试剂 12

2.2.4 其他相关实验材料 12

2.2.5 主要仪器 12

2.3 主要溶液 12

2.4 主要实验方法 12

2.4.1 表达载体的构建 12

2.4.2 融合蛋白的原核表达与纯化 16

2.4.3 免疫共沉淀 18

2.4.4 融合蛋白的真核表达 18

2.4.5 Western blot实验 19

2.4.6 免疫荧光实验 19

3 实验结果与分析 20

3.1 Ezrin蛋白的表达与分离纯化 20

3.2 Ezrin蛋白的磷酸化调节 20

3.2.1 Ezrin磷酸化对乙酰化修饰的影响 20

3.2.2 免疫共沉淀（CO-IP） 21

3.3 Ezrin蛋白在细胞中的定位 22

3.3.1 Ezrin在肾细胞来源的LLC-PK1中的定位 22

3.3.2 Ezrin在胃壁细胞内定位（原代细胞） 23

结 论 24

参 考 文 献 25

致谢 28

1 Ezrin蛋白

ERM蛋白家族由Ezrin、Radixin、Moesin这三种具有相近结构的蛋白组成，它们之间有75%～80%的同源性。它们在调节细胞骨架与细胞质膜的相互作用中具有重要的作用，同时，它们还是极化细胞中组成信号传导通路的重要成分，在细胞形态与运动的维持、调节信号转导及连接粘附分子等方面具有重要功能。Ezrin是极化表皮细胞的一个顶膜标记蛋白，它最初是作为蛋白质酪氨酸激酶受体的底物分离出来。据研究表明，很多肿瘤转移均与Ezrin在肿瘤细胞中的非正常表达有关^[1]。

1.1 Ezrin蛋白的生物学特性

1.1.1 Ezrin蛋白的分布

Ezrin蛋白主要分布在微绒毛，细胞膜，纤毛和细胞间的连接处，同时它还与肌动蛋白的结合有关。

1.1.2 Ezrin蛋白的结构

Ezrin蛋白最先由Bretscher 在鸡的小肠上皮细胞刷状缘中分离纯化出来，进一步研究表明，Ezrin 位于染色体 6q25.2- q26，相对分子质量为 81kDa，长度为1761 bp，编码587个氨基酸^[1]。Ezrin 蛋白是由3个结构域组成^[2,3]：一是FERM结构域，Ezrin蛋白分子内的N-末端和C-末端结构域之间的相互作用掩饰了蛋白之间相互作用的位点，并且维持该蛋白质在细胞质中的非激活状态^[4]，同时Ezrin可与磷脂PIP2结合，并在C末端的苏氨酸残基域发生磷酸化^[5]。当Ezrin在N-末端域被激活，FERM（Four-point-one, Ezrin,Radixin, Moesin）结构域可以与跨膜蛋白的细胞质部分结合，如CD44、ICAM、细胞质膜支架蛋白^[6]和EBP50 ^[7,8]；二是α螺旋区，Ezrin的中心区域包含α螺旋结构；三是极性的肌动蛋白结合区，含有苏氨酸的磷酸化位点。这是Ezrin蛋白C端含有的一个丝状肌动蛋白/FREM结合域，它对与PKA的联系、F-actin的调控以及分子内互作具有非常重要的作用^[9]。

研究表明，在区分上皮细胞的组织、胞质分裂中对细胞皮层的固定、上皮的完整性和上皮管的管腔形态等各种单元中，Ezrin均具有非常重要的作用^[10]。

1.1.3 Ezrin蛋白的表达

Ezrin 在大部分组织中均有表达，但是在不同的组织中还是存在不同的表达水平。其中在小肠、肺、胃、胰腺和肾中具有较高的表达水平，在脾、淋巴结、骨髓、胸腺种的表达水平次之，而在心脏、脑和肌肉中则表现较低的表达水平^[11]。

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