环糊精葡萄糖基转移酶生产菌BC34发酵条件优化

 2023-09-15 08:09

论文总字数：10523字

摘 要

对实验室获得的菌株进行初步筛选，确定高产β-CGTase的BC34号菌株。为获得有较高活力的CGT酶，对其发酵条件进行优化。单因素实验确定最优碳源、氮源，Plackett-Burman试验确定玉米淀粉、碳酸钠为影响发酵的主要因素，响应面分析最终得出发酵的最优条件：玉米淀粉20g/L, Na2CO3 10g/L，牛肉膏10g/L， K2HPO4 1g/L，MgSO4`7H2O 0.2g/L，NH4NO3 10g/L。

关 键 词：环糊精，环糊精葡萄糖基转移酶，发酵条件优化

Abstract: Preliminary screening of the strains which were provided by the laboratory to determine the high β-CGTase producing strains BC34. The fermentation conditions were optimized to obtain a β-CGTase with much enzyme activity. Carbon sources and nitrogen sources were determined by single factor test. The main factors affecting the fermentation of β-CGTase were corn starch and sodium carbonate by Plackett Burman experiment. The optimal conditions for fermentation were further determined by response surface methodology: corn starch 20g/L, Na2CO310g/L, beef extract10g/L, K2HPO4 1g/L, MgSO4`7H2O 0.2g/L, NH4NO310g/L.

Keywords: cyclodextrin, cyclodextrin glycosyltransferase, optimization of fermentation conditions

目 录

1 前言 3

2 材料与方法 3

2.1 菌种 4

2.2 培养基 4

2.3 实验设备 4

2.4 试剂 4

2.5 方法 4

3 结果与分析 6

3.1 菌株筛选 6

3.2 碳源种类对产酶的影响 7

3.3 有机氮源种类对产酶的影响 8

3.4 无机氮源种类对产酶的影响 9

3.5 Plackett-Burman实验 9

3.6 响应面分析 11

3.7 验证实验 14

结 论 15

参 考 文 献 16

致谢 18

1 前言

环糊精是直链淀粉在环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucanotransferase, CGTase)作用下生成的一系列环状低聚糖的总称。许多D-吡喃葡萄糖残基通过α-1,4-糖苷键首尾相连形成不同的环糊精[1]，根据其含有的葡萄糖残基个数不同可分别称为α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精[2]。环糊精分子具有中空的“管道”状结构，其外部具有大量亲水羟基，内部则形成疏水空腔，因此环糊精可在溶液中与多种有机物形成包合物[3~4]。1930年F.Cramer首次提出环糊精可以包埋色素，对此深入研究后发现α-环糊精可与甲基橙形成包合物并用分光光度计法来测定其含量[5]，β-环糊精可用酚酞法测定含量[6]，γ-环糊精可用溴甲酚绿法测定含量[7]。在3种环糊精中，β-环糊精应用最广泛，其优势为溶解度最小，易结晶，便于获得，价格相对低廉[8~9]。

研究初期曾使用化学合成法制备环糊精,后因其工艺复杂、成本高、产率低而逐渐被淘汰 [10]。为降低成本，实际生产中多采用生物酶转化法，即利用自然界中微生物生产发酵CGT酶催化合成环糊精。能够产CGT酶的菌种来源有很多，通常为需氧或厌氧嗜热菌，例如地衣芽孢杆菌、环化芽孢杆菌、肺炎克雷伯菌等，这也是生物酶转化法成本较低的原因。CGT酶具有蛋白质一级结构、结构域及活动中心，是一种可以催化分子内和分子间的转糖基反应并可以发生水解反应 [11~12]的多功能酶，有利于研究其生产特性。

现如今环糊精及其衍生物已被广泛应用于各个领域。在食品领域[13]中有用作食品着色剂的，有用于果蔬防腐包装的；在医药领域[14]中有作为医药辅助剂增加药物的溶解度、降低毒副作用的，有在DNA切割、光动力学疗法、药物载体方面发挥复合物优势的[15]；在分析化学领域中作为高效液相和气相色谱的固定相来拆分化合物对映异构体，还可以作为掩蔽剂提高电化学测定的准确度[16]；纺织上浆以及废水的处理[17]等。在环糊精的应用上，还有许多总体水平较低的领域，比如在烟草领域，未来研究重点将在于环糊精对有害成分的阻留及香气的缓释[18]。

自1960年日本首次实现环糊精的工厂化生产以来，世界各国相继在环糊精的性状研究以及生产应用上投入大量资本。目前日本在环糊精的工业生产与应用研究上仍处于世界领先地位，而我国正处于后来者居上的形势，为了更有效的利用资源、降低实验室研究及工业生产成本，如何提高环糊精产量具有重要实践意义。提高环糊精产量的关键在于提高CGT酶的产量，优良的菌种、适宜的生产方法和培养条件是获得高产酶量的保证[19]。因此本实验旨在研究高产CGT酶菌株的发酵条件优化，为相关研究工作提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 菌种

实验室获得,编号为50-2，31-2，34

2.2 培养基

表1 培养基成分

初筛平板培养基（g/L）

发酵培养基（g/L）

种子培养基（g/L）

可溶性淀粉10g

蛋白胨5g

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