几种硝化抑制剂对土壤微生物及N2O排放的影响

论文总字数：18156字

目 录

摘要 1

Abstract 2

1.前言 3

2.材料和方法 4

2.1供试土壤概况 4

2.2土壤样品的处理与培养 4

2.3气体的采集与测定 5

2.4土壤硝态氮的测定 5

2.5土壤微生物DNA的提取 6

2.6 目的基因的荧光实时定量PCR 分析 6

2.7统计分析 7

3.结果与分析 7

3.1不同硝化抑制剂对温室气体N₂O排放的影响 7

3.2不同硝化抑制剂对氮素转化的影响 9

3.3土壤总DNA的浓度、纯度分析 10

3.4不同硝化抑制剂对对土壤中不同类型微生物的丰度的影响 11

4.讨论 16

5.结论与展望 17

参考文献： 19

致谢 21

三种硝化抑制剂对土壤微生物丰度及N₂O排放的影响

张洁

，China

Abstract:With high pursuit of efficient agricultural production and quality, N has gradually been paid more attention to a more efficient use as a crop of important nutrient elements and one of the three fertilizer elements. o. In this study, we aimed to explore the effects of different nitrification inhibitors to improve the efficiency of N utilization. . three nitrification inhibitors were selected to investigate their effects on soil microbes and N₂O emission. Through gas chromatography analysis, we found that DCD had the best effect on the nitrification inhibition of the tested soil and reduced N₂O emission significantly. The results by rea-time PCR also showed that ammonia-oxidizing bacteria (AOB) mainly dominanted the nitrification process of the soil, and nitrification inhibitors significantly affected their quantity and activity. While the abundance of the another nitrifying microorganism-Ammonia-oxidizing archaea- was not changed. This paper provides a scientific basis for selecting suitable nitrification inhibitors for the tested soils and clarifies the effect of nitrification inhibitors on soil microbes.

Key words: Nitrification inhibitors; Nitrate nitrogen; N₂O; microorganism; Ammonia -oxidizing bacteria; Ammonia-oxidizing archaea

1.前言

氮素作为作物生长所必需的大量元素，肥料要素，在农业生产中对作物的产量和质量产生直接的影响，故氮素的高效利用成为生产实践中关键问题。但是，土壤中存在许多种氮素损失途径，直接减少了土壤中作物可利用态氮量，降低氮肥的增产效益，其中，以硝化作用最为突出。硝化作用的生成物-硝态氮（NO₃^-），在土壤中移动性极大，极易淋溶损失，严重时甚至会产生环境污染-水体富营养化，而硝化作用的中间产物亚硝酸根（NO₂^-）在缺氧环境下会发生反硝化作用而造成氮素的再次逸失。再者，硝化过程中的氨氧化作用易产生副产物N₂O，N₂O作为一种重要的温室气体，对全球的气候变化产生影响，并具有对平流层臭氧的破坏作用^[1]。同时，氮循环问题也逐渐引起了人们的关注，氮循环是指空气中的惰性气体N₂经固氮作用转变为活性氮（NH₄），然后硝化形成硝酸根（NO₃^-），最后通过反硝化作用变为N₂或含氮的气态分子又重新进入大气中的一次简单的氮循环。尤其在农田生态系统中，氮循环影响甚至控制着其他养分或物质的循环和利用，故对其三个重要循环过程的研究与控制对农业生产有着重要意义，而本试验主要研究其氮循环中的硝化作用。

土壤中硝化作用具体可分为两个过程，铵态氮（NH₄ ）先在亚硝化细菌的作用下转化为中间产物-亚硝态氮（NO₂^-），然后在硝化细菌的作用下最终转化为硝态氮（NO₃^-），可简称为氨氧化（Ammonia oxidation）和亚硝酸盐氧化（Nitrite oxidation），其中，因NO₂^-极易被氧化为NO₃^-[2],硝化作用的限速过程为氨氧化过程。显然，土壤微生物在硝化过程中起着至关重要的作用，主要包括氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）。已知氨单加氧酶（AMO)为氨氧化微生物特有的一种胞内酶，对NH₃氧化生成羟胺起催化作用,为自身提供能量^[3]。硝化抑制剂能抑制微生物的活性（通过与氨氧化微生物的AMO 竞争底物、螯合AMO的活性位点或被AMO氧化后的产物抑制其他蛋白质等方式）抑制硝化作用^[4]。

目前，DCD、DMPP、乙炔、Nitrapyrin、芳香族化合物等硝化抑制剂常用于农业生产中，优点为效率高、成本低、施用方便安全和对环境影响小^[4]。适量硝化抑制剂与肥料同时施入土壤对农田土壤N₂O减排是目前为止是最有效的方法。生物抑制剂DMPP对硝化细菌（AOB）有毒害作用^[5]。Weiske（2001）研究结果表明，土壤中施用含DMPP的氮肥的显著优点为减少23%硝态氮的损失^[6]。

此外，实验室在研究氨氧化过程内在机理时用到的新型硝化抑制剂还包括烯丙基硫脲（Allylthiourea，ATU）、2-亚氨基-4-硫化缩二脲（ASU）和carboxy-PTIO等^[7]。在实验室条件下，发现低浓度carboxy-PTIO就能完全抑制氨氧化古菌的硝化作用，而高浓度时对氨氧化细菌仍然不敏感；ATU和ASU能显著抑制氨氧化细菌，对古菌不敏感^[8]。

由此可见，不同硝化抑制剂对土壤中不同氨氧化微生物类群的敏感程度不同，可能导致在土壤中硝化抑制剂抑制效果的差异。所以，研究不同硝化抑制剂在同一种土壤中的抑制效果，并与分子生态学方法相结合，能够更加充分的探索不同土壤硝化微生物组成对硝化抑制剂的响应特征，为针对性的选用适宜硝化抑制剂提供理论依据。

本课题研究有助于明确硝化抑制剂对氮素损失及温室气体N₂O排放的影响，为实际生产中合理高效地使用硝化抑制剂及控制温室气体排放提供依据。同时，深化硝化过程微生物学机理的理论内涵。

2.材料和方法

2.1供试土壤概况

供试土壤取自于农业气象试验站（32°07′N，118°50′E）。于2017年3月4日用土钻、土铲等工具采用五点交叉取样法获取0-20 cm土层的耕层土壤500 g，组成混合代表样，该土壤的基本理化性质为：pH 5.86；含水率 2.85%；硝态氮 10.21mg/kg。

2.2土壤样品的处理与培养

将供试土壤去除杂物、碾碎，使之通过2 mm 筛子并混匀。同时，洗净并烘干33个玻璃培养瓶以供试验使用。称取相当于6g干土的新鲜土壤样品（6.18g）于准备好的玻璃培养瓶中，并加入800μl无菌去离子水以调节持水量。然后，用橡胶塞塞紧瓶口，放入培养箱中于28℃在黑暗中进行24h的预培养。

完成预培养后，将培养瓶取出，打开橡胶塞，加入试验所需的试剂。本次试验选取三种硝化抑制剂进行比较，分别为Dicyandiamida（DCD，双氰胺，C₂H₄N₄，浓度设置：15%）、Nitrapyrin（NP，硝酸嘧啶，2-氯-6-三氯甲基吡啶，浓度设置：1.5%）、Allylthiourea（ATU，烯丙基硫脲， C₄H₈N₂S，浓度设置：5%）。除3个零时刻土壤样品外，本试验共5个处理，其中H处理和N处理分别为对照，每个处理做六个重复，其中3个进行两周的培养，标为“-2W”，3个进行四周的培养，标为“-4W”，具体处理安排见表1。本试验中N源为尿素，且按200μg N/g d.w.s加入土壤。分别加入底物后，塞上橡胶塞，加紧铝帽，置培养箱28℃进行好氧培养，培养2周或4周。培养2周或4周后，土壤样品取0.5g于2.0ml灭菌带帽离心试管中,进行DNA的提取和分析，并做两个重复，其余全部转移到无菌密封袋中，于-20℃冰箱保存，以便后续试验使用。

表1 试验处理安排

2.3气体的采集与测定

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