乌苏里拟鲿ghrelin基因克隆及分析

论文总字数：18167字

摘 要

乌苏里拟鲿（Pseudobagrus ussuriensis）是一种名贵淡水经济鱼类，广泛分布于我国北方水系，因其营养丰富、肉质鲜嫩，现如今逐渐成为我国的一种名特优养殖产品。Ghrelin又称为生长激素促分泌素，是脊椎动物的生长激素释放肽，参与摄食调节，起到能量平衡调控和糖类代谢的作用。本研究通过乌苏里拟鲿ghrelin基因克隆、采用生物信息学方法，得出乌苏里拟鲿的ghrelin基因的长度为339 bp。对乌苏里拟鲿的核苷酸序列和氨基酸序列与其他物种进行对比分析发现乌苏里拟鲿与鲿科鱼类相似度较高，亲缘关系较近，与其他鱼类和哺乳动物的相似度较低，亲缘关系远。本研究通过克隆测序方法获得的乌苏里拟鲿ghrelin基因序列，将为今后该基因的多态性位点与生长性状的关联性分析、乌苏里拟鲿摄食与生长的机制研究、分子标记辅助育种等提供参考。

关键词：乌苏里拟鲿，Ghrelin基因，基因克隆，序列对比分析

Abstract: Pseudobagrus ussuriensis is a valuable freshwater fish, widely distributed in northern China. Because of its rich nutrition and tender meat, it is now becoming a famous and excellent culture product in our country. Ghrelin, also known as growth hormone secretin, is a growth hormone releasing peptide in vertebrates, which participates in feeding regulation and plays the role of energy balance regulation and carbohydrate metabolism. In this study, ghrelin gene of Pseudobagrus ussuriensis was cloned and the length of its coding region was 339 bp. We also found the similarity of nucleotide sequence and amino acid sequence in Pseudobagrus ussuriensis is high with cyprinid fishes, and is low with other species by comparing the nucleotide and amino acid sequences of Pseudobagrus ussuriensis with those of other species. The ghrelin gene obtained in this study, will provide useful materials for association analysis between polymorphism of the gene and the growth traits, study of the mechanism of feeding and growth, and molecular marker assisted breeding for Pseudobagrus ussuriensis.

Keywords: Pseudobagrus ussuriensis, Ghrelin gene, Gene cloning, Sequence analysis

1 前言

1.1 Ghrelin基因研究概况

Ghrelin又称为生长激素促分泌素，主要在胃肠道内产生。Ghrelin是生长激素促分泌素受体（growth hormone secretagogue receptor，GHSR）的内源性配体， Ghrelin是继生长激素释放激素（Growth hormone releasing hormone，GHRH）和生长激素抑制素（Somatostatin，SRIF）后发现的第三种调节生长激素（Growth hormone，GH）分泌的多肽^[1]，ghrelin与GHSR结合所构成的GHSR/Ghrelin系统是调节机体生长激素分泌的重要通路^[1]。

Ghrelin基因包含3个内含子和4个外显子，结构保守^[2]。大多数动物的Ghrelin翻译蛋白序列含28个氨基酸^[3]，乙酰化的 ghrelin 才能结合 ghrelin 受体，并发挥生物学效应，增加摄食量；去乙酰化的ghrelin不能结合GHSR^[4]，但却能促进胰岛素（insulin）的分泌^[5]。

早期研究集中在ghrelin对哺乳动物的生长调节上，发现ghrelin能够促进垂体生长激素的分泌、调节动物摄食等^[6]。在对鱼类ghrelin 基因的研究中也发现其具有类似的功能^[6]。它具有促进生长激素（growth hormone，GH）分泌作用^[7]、还能参与糖脂代谢、细胞分化、促进摄食、心血管功能的调节等多种生理功能^{[8- 9]}。此外ghrelin还被认为是联系生殖和能量代谢的桥梁信号分子^[10]。目前已有尼罗罗非鱼ghrelin的多态性及其与生长的相关性研究；草鱼ghrelin基因的分子克隆与组织分布及其摄食调控作用分析；南方鲇Ghrelin基因克隆及其mRNA表达研究等。

1.2 乌苏里拟鲿概述

乌苏里拟鲿（Pseudobagras ussuriensis）曾用名乌苏里鮠，俗称牛尾巴，隶属于鲶形目,鲿科，拟鲿属，目前乌苏里拟鲿主要分布于我国黑龙江至珠江的各水系，在我国太湖、洪泽湖也有分布和资源量^[11]。该鱼无鳞、无肌间剌、肉质细嫩、具有多种保健功能，早在《本草纲目》中就有该鱼的记载，是我国特产的名贵淡水鱼类品种^[12]。在20世纪80年代，乌苏里拟鲿的天然捕捞量曾仅次于同科的黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidsco）， 然而由于捕捞强度的持续增长、环境污染及生境破坏等因素的影响,其野生资源量锐减，目前在很多自然分布区已很难捕获野生个体^[13]。

近年来有关乌苏里拟鲿的研究主要有对其品质的评价、适宜蛋白能量水平和氨基酸需要量的研究^[14]，与瓦氏黄鳝鱼的杂交^[15]，雌雄鱼生长及周年性激素与性腺发育研究^[16],养殖生物学^[17]、营养与饲料^[18]等方面，这为乌苏里拟鲿作为经济鱼类的开发、养殖、资源增殖等奠定了基础。

1.3 研究目的与意义

目前多种鱼类中已开展ghrelin基因的相关研究，且其结构和生理功能存在较大种间差异，而乌苏里拟鲿中尚未报道。本研究拟通过基因克隆法，获得乌苏里拟鲿ghrelin基因序列并分析其与其他物种ghrelin基因氨基酸序列关系，为以后乌苏里拟鲿生长性状的关联性分析奠定基础，从而为乌苏里拟鲿的分子标记辅助育种提供潜在可能，以期在将来获得质量更佳的乌苏里拟鲿，提高养殖产量。

2 材料与步骤

2.1 实验材料

2.1.1 实验所用仪器

BSA124S 电子天平

Gel Doc^TM EZ Imager凝胶成像系统

VORTEX-5震荡器

DYY-6C型电泳仪电源

Eppendorf单道移液枪

UVG20 紫外割胶仪

T100^TM Thermal Cycler PCR仪

DK-S24电热恒温水浴锅

HPS-160 生化培养箱

Mini-7k 微型离心机

IMS-100 全自动制冰机

2.1.2实验所用其他材料、试剂

乌苏里拟鲿 取自实验室人工养殖

质粒 Takara公司

DH5 α感受态细胞

AGAROSE G-10 琼脂糖

LB AMP 有氨苄青霉素LB液体培养基

LB AMP- 无氨苄青霉素LB液体培养基

HiFi-Script cDNA Synthesis Kit第一链合成试剂盒

Gel Extraction Ki琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒

2.2 研究步骤

2.2.1 设计引物

根据NCBI Genbank中黄颡鱼的proghrelin相应的保守氨基酸序列，使用Primer Premier 5.0设计需要克隆的乌苏里拟鲿ghrelin基因核心片段的简并引物（表1）。

表1本研究所设计引物信息

引物名称	上游序列（5’-3’）	下游序列（5’-3’）	扩增长度（bp）	退火温度（℃）
Pughrelin1	AGAGATGCTCATCATGCTGG	GGATACTTTCCGTTCAAACTGT	367	55.5
Pughrelin2	ATGCTCATCATGCTGGGTC	AATCAGGATACTTTCCGTTCA	368	55.8

2.2.2 乌苏里拟鲿胃组织总RNA提取

乌苏里拟鲿胃组织总RNA提取全过程必需佩戴乳胶手套，除离心外的所有操作均必须在酒精灯火焰旁进行，操作过程中需配戴口罩，以免样品污染。

1）取一盒冰，一个培养皿，消毒的剪刀和镊子，将组织取出后立即置于冰上，防止RNA降解。

2）取一条乌苏里拟鲿，剪短脊髓，切取胃组织，迅速地加入到装有500 μL TRIzol Reagent提取液的2 mL的EP管中，用匀浆器在冰上将样品彻底匀浆。

3）匀浆后的样品在室温下放置5 min，以彻底分裂核蛋白复合体。

4）加入0.1 mL氯仿剧烈摇晃15 s，使充分混合后室温静置2-5 min。

5）12,000 r/min转速于4 ℃离心15 min，离心后分为三层，RNA主要位于无色水相中。

6）转移上清，用移液枪加入0.25 mL异丙醇，混匀后静置10 min。

7）12, 000 r/min转速于4 ℃离心10 min，在EP管管侧和管底出现少量胶状沉淀。

8）缓慢倒掉上清，用移液枪加入0.5 mL 75％乙醇（用无水乙醇和DEPC处理的无菌水配置）轻轻洗涤，能见到少量白色片状沉淀。

9）9000 r/min转速于4 ℃离心5 min，慢慢倾去废液，放置在超净台上空气干燥5-10 min，加无RNA酶水（25-200 μL）溶解2-3小时。

10）检测合格的RNA放置超低温冰箱保存待用。

2.2.3 核心片段扩增

1. cDNA第一链合成

根据下表配置反应体系，总体积为20 μL。按照HiFi-Script cDNA第一链合成试剂盒说明书进行实验操作。

试剂	20 μL反应体系
dNTP Mix，2.5mM Each	4 μL
Primer Mix	2 μL
RNA Template	5 μL
5×RT Buffer	4 μL
SuperRT: 200U/μL	1 μL
DTT: 0.1M	2 μL
RNase-Free water	2 μL

适当涡旋震荡混匀，短暂离心一下之后，用PCR仪孵育后短暂离心，即可置于-20 ℃长期保存。

1. 对引物稀释处理

在离心管内加入90 μL灭菌超纯水内加入上下游引物各5 μL（共计100 μL），震荡十几秒再离心几秒钟，即完成对引物的初步处理。

2.2.4 目的片段PCR扩增

根据下表配置PCR反应体系，总体积为13 μL。

试剂	13 μL反应体系
超纯灭菌水	10 μL
10×Buffer	1.25 μL
dNTP	0.4 μL
引物	0.4 μL
DNA	1 μL
Taq DNA聚合酶	0.1 μL

按照52 ℃退火温度，35个循环的PCR扩增条件调节PCR仪，进行PCR扩增。

2.2.5 琼脂糖凝胶电泳检测及目的DNA纯化回收

1）用1％琼脂糖在230 V，109 mA条件下电泳检测PCR产物，电泳结束后放置Gel Doc^TM EZ Imager凝胶成像系统成像，引物2符合条件，用引物2的体系做5管同样的PCR扩增，混合摇匀，取适量进行电泳检查，检查结果合格将全部体系进行电泳，在紫外割胶仪中切割目的片段；根据下表内容，按照DNA回收试剂盒说明书操作步骤回收DNA。

试剂及操作	体积
加入Buffer PG	600μL
50 ℃孵育10min，其间每隔2-3min温和地上下颠倒离心管
向吸附柱中加Buffer PS	200 μL
离心弃废液，加入孵育过的溶液，离心弃废液
向吸附柱中加Buffer PW	500 μL
离心弃废液，晾干
向吸附膜悬空滴加无菌超纯水	50 μL
离心收集DNA溶液，-20 ℃保存

2.2.6 Ghrelin基因片段克隆

（1） 连接

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