论文总字数：11295字

摘 要

大肠杆菌是人畜肠道内的常驻菌群，对肠道生理活动具有重要意义，但在一定情况下也会转变为致病菌引发肠道疾病。通过对大肠杆菌的基因进行测序分析有利于了解该菌株的变异程度从而对大肠杆菌病的防治提供方向。本研究对镇江江滨医院所提供的10株人源大肠杆菌菌株HEC选取两个基因ADK（腺苷酸激酶基因）和ASPC（天冬氨酸转氨酶基因）通过PCR扩增，凝胶试剂盒回收纯化，采用TA克隆法克隆并测序。所得结果在GenBank网站上进行BLAST比对验证，然后用MEGA7.0软件构建进化树，并通过ExPASy网站蛋白质在线分析工具对基因编码产物进行分析预测，结果初步表明了10株人源大肠杆菌的同源性较高，但9号菌株基因发生变异的程度比较明显。对后续研究以及由这类致病大肠杆菌引发的大肠杆菌病的防治有一定的参考意义。

关键词：人源大肠杆菌，ADK、ASPC基因克隆，序列分析，进化树，蛋白质分析

Abstract: E. coli is a resident flora of the human and animal intestines. It plays an important role in the physiological activity of the intestine. However, in certain cases, it will turn into pathogenic bacteria and cause intestinal diseases. The sequencing analysis of the E. coli gene will help to understand the degree of variation of the strain and provide direction for the prevention and treatment of E. coli disease. this research selected two genes including ADK and ASPC of the human E coli provide by JiangBin hospital in Zheng Jiang. After PCR amplification, gel extraction, TA gene coloning and sequencing, the result was submited to GeneBank for verification. Then made phylogenetic tree by MEGA7.0 and predicted the characteristics of the gene coding production by ExPASy. The result showed that all these bacterial strain have high homology, while the 9^th acquire apparently mutation, which made some contributions to follow-up research and HEC disease prevention. .

Keywords : human E coli , ADK、ASPC gene clone , sequence analysis , phylogenetic tree , protein analysis

目录

1前言： 4

2 材料和试剂 5

2.1菌株及主要试剂 5

3实验步骤 5

3.1 PCR 5

3.1.1 菌种复苏 5

3.1.2 热裂解法提取大肠杆菌DNA模板 6

3.1.3 引物稀释 6

3.1.4 PCR 6

3.1.5 PCR产物纯化 6

3.2 T载体与PCR产物连接 6

3.3 重组质粒转化感受态细胞 6

3.4 重组质粒的筛选与鉴定 7

3.5 碱裂解法提取质粒 7

3.6 双酶切鉴定 7

3.7 重组质粒插入片段的序列测定 7

4结果 8

4.1 PCR 8

4.2 重组质粒的筛选与鉴定 9

4.3序列分析 11

结果及讨论 14

参考文献： 16

致谢： 18

附录1 19

ADK和ASPC基因测序结果（部分） 19

附录2 20

基因序列BLAST比对结果 20

1前言：

大肠杆菌是广泛分布于人和动物肠道的有益菌群。在某些条件下会成为致病菌，可分为肠致病性大肠杆菌（EPEC）和肠道外致病性大肠杆菌（ExPEC）^[1]，EPEC常导致患者出现腹泻、出血性肠炎甚至溶血性尿毒综合征等严重的并发症，死亡率高^[2]，其形态与普通大肠杆菌相似且不易检测，目前已成为儿童肠道感染的主要病原菌^[3]。ExPEC主要包括尿道致病性大肠杆菌(UPEC)和败血性大肠杆菌（SEPEC），可导致泌尿系统感染和败血症等^[4]，甚至引发大规模感染。因此，大肠杆菌感染的严重性不容忽视。

PCR（多聚酶链式反应）是体外大量扩增DNA的常用手段，其产物可以通过基因克隆进行扩增以便后续的基因诊断或测序等操作。T载体作为目前一种用于PCR的产物克隆的新型载体具有简单易行，快速简便等优点^[5,6]。此外，该方法通过黏性末端将载体与片段连接在一起，因而连接效率要高于平末端的连接效率。利用T载体基因克隆的主要原理是在PCR扩增反应中，由于Taq DNA聚合酶具有非模板依赖的末端转移酶活性，因而会在PCR产物的3’端附带一个A碱基，能与T载体末端所带有的T碱基互补配对，故能够快速的进行PCR产物的克隆，因而将该方法命名为TA互补克隆^[7-9]。

ADK基因（腺苷酸激酶基因）以及ASPC基因（天冬氨酸转氨酶基因）都属于大肠杆菌的管家基因，即在所有细胞中均要稳定表达的一类基因，具有高度保守性。管家基因的编码产物对于维持细胞基本生命活动是必需的,因此选择管家基因进行测序分析具有一定的代表性^[10]。ADK基因即腺苷酸激酶基因编码腺苷酸激酶，能催化ATP分子末端的磷酸基团转移至AMP分子上生成ADP。ASPC基因即天冬氨酸转氨酶基因编码天冬氨酸转氨酶，催化天冬氨酸的转氨基作用。这两个管家基因的编码产物都参与大肠杆菌日常生理代谢活动，因此对于大肠杆菌生长具有不可或缺的意义。本实验即对大肠杆菌这两个保守性高的基因采用PCR扩增，通过基因克隆测序，将测序结果制作进化树并对基因编码产物的基本特性做预测分析从而初步判断这10株人源大肠杆菌的进化关系和变异程度，为后续的研究打下基础。

材料和试剂

2.1菌株及主要试剂

10株人源大肠杆菌菌株为镇江江滨医院提供，均采自病患上呼吸道、尿道等分泌液。选取的2个管家基因ADK、ASPC参考Wiley Online Library设计引物，引物序列见表1，由上海赛百盛公司合成。PCR试剂包括Taq polymerase、dNTPs、Taq酶反应缓冲液（含镁离子）均购自北京佳兰公司，TA克隆所需限制性核酸内切酶Pst1、BamH1以及TA连接试剂盒均购自TaKaRa公司。PCR产物纯化回收的凝胶试剂盒、pUC19质粒以及大肠杆菌感受态细胞DH5α均购自北京康为世纪公司。

表1 PCR引物序列

剩余内容已隐藏，请支付后下载全文，论文总字数：11295字