羰基还原酶产生菌的筛选与分离

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摘 要

6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯[(3R，5R)-CDHHB]现在常用于合成阿托伐他汀钙，常用于在生物上制备手性醇。近几年来，随着社会的发展，羰基还原酶通常是作为生物催化剂，来参与生物的合成研究，并且还原酶在工业上的应用也日益增多。从土壤中筛选得到一株具有还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基已酸叔丁酯活性的菌株5-1-k4a，结合表型特征、生理生化特征和分子遗传学，确定菌株5-1-k4a属于季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)。研究了P．guilliermondii细胞还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基已酸叔丁酯生成6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯过程中其羰基还原酶的酶活性质。

关键词：6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯[(3R，5R)-CDHHB]；羰基还原酶；阿托伐他汀钙

Abstract: In recent years, carbonyl reductase is involved in the biosynthesis research, and carbonyl reductase usually as a biocatalyst in the study,and the applications of carbonyl reductase in industrial is increasing. With the development of society, and carbonyl reductase is used in biological reducing prochiral ketones chiral alcohol commonly.We screened out the strain 5-1-k4a from the soil, and the strain has the activated of a non-enantioselective reduction of 6-cyano-(5R)-hydroxy-3-tert-butyl-carbonyl. We combine with phenotypic characteristics, physiological and biochemical characteristics, the strain 5-1-k4a is determined to belonging to Pichia guilliermondii. The experiment studied the carbonyl reductase enzymatic activity nature further in the process of P. guilliermondii 5-1-k4a Asymmetric Reduction of 6-cyano-in - (5R) - hydroxy-3-carbonyl has generated 6-cyano-tert-butyl - (3R, 5R) - tert-butyl-dihydroxy .And we preliminary make sure that the optimal catalytic conditions to carbonyl reductase is 35 ℃, and the optimal pH value is 7.0, the optimal conversion time of carbonyl reductase is 40 h.

Key words: 6-cyano-tert-butyl -(3R, 5R) - tert-butyl-dihydroxy [(3R，5R)-CDHHB] ,Carbonyl reductase, Atorvastatin calcium

目录

1前言 5

2材料与方法 5

2.1 菌株 5

2.2 试剂 5

2.3 主要仪器设备 6

2.4 主要培养基 6

2.5 菌种筛选 7

2.6 菌株鉴定 7

2.7 酶活性质测定 7

3结果与讨论 8

3.1 实验结果的测定 8

3.2 羰基还原酶性质 9

3.3 培养时间对5-1-k4a细胞羰基还原酶活性的影响 9

3.4 温度对5-1-k4a细胞羰基还原酶活性的影响 9

3.5 ph值对5-1-k4a细胞羰基还原酶活性的影响 10

4 结论 11

参 考 文 献 13

致 谢 15

1 前言

随着社会的发展，人类的生活越来越趋向于现代化，自动化，人类越来越依赖于电子设备，智能系统，缺少一些必须的生活运动。并且随着生活条件的不断提高，人类患有高血脂的概率越来越高。阿托伐他汀是现在临床上治疗高血脂症的首选药物，且氰基-(3R，5R)-二羟基已酸叔丁酯[(3R，5R)-CDHHB]是合成阿托伐他汀钙的关键手性前体^[1]，传统的6-氰基-(3R，5R)-羟基己酸叔丁酯化学合成法不仅使用昂贵的硼烷类试剂和正丁基锂，而且要在低于-60℃的条件下进行反应，消耗大量的能量和有机溶剂^[2-5]。化学法合成[(3R，5R)-CDHHB]需要使用易燃试剂硼烷^[6]，且差向选择性诱导不充分，产物光学纯度低。生物催化具有高对映体选择、高区域选择性以及环保低耗的优势，在倡导绿色环保低碳节能的大趋势下，采用生物催化技术合成[(3R，5R)- CDHHB]具有优势^[7-8]。

羰基还原酶来源广泛，是一种具有高度的化学、区域和立体选择性的生物催化剂，常用于生物还原前手性酮制备手性醇^[9]。近几年来，用羰基还原酶作为生物催化剂参与生物合成研究，且在工业上的应用日益增多，也越来越实用，适合于实验的发展。本实验旨在筛选一株具有转化[(3R，5R)-CDHHB]能力的菌株，并研究其羰基还原酶的酶学性质。

此次实验成功筛选得到具有转化6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯活性的菌株5-1-k4a，对其进行菌种鉴定，经Biolog法鉴定，结果表明 5-1-k4a菌株为季也蒙毕赤酵母细胞（P．guilliermondii ）。再进行酶活性质的测定并研究其催化性能，以建立6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物催化合成工艺。6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯是合成他汀药物的重要手性中间体， 一些学者报道了化学催化还原方法：Wess 等^[12]在低温条件下利用三乙基硼/硼氢化钠催化还原合成二羟基酯；Everaere 等^[13]使用氯化钌/β-氨基醇还原5-羟基-3-羰基酯， 但是de值只有80%左右。化学催化剂法需要在苛刻条件下进行，并且选择性差。相对而言，生物酶法具有条件温和、选择性高等优势^[14]。

所以，在为了节省材料，以及方便实验的情况下，我们优先选择运用生物法来进行实验。

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