论文总字数：20680字
摘 要
实验利用CRISPER/cas9系统对水稻的JAZ6基因进行定向编辑，以探究其在水稻花器官生长发育过程中的作用。以水稻品种‘粳稻生态型9522’为实验材料，经基因编辑后的共获得20株转基因水稻植株，鉴定出阳性植株8株，其中6株纯合突变、2株杂合突变。突变株基因所编码的氨基酸结构都发生了改变。表型鉴定的结果表明，突变株的颖花与雄蕊未正常发育，说明JAZ6基因参与了水稻花器官的形成过程。关键词：水稻、茉莉素、JAZ6、CRISPER/Cas9、花器官发育
Abstract: In this experiment, the Crisper/cas9 system was used to edit the JAZ6 gene of rice, In order to explore Its role in the growth and development of flower organs in rice.The rice variety "japonica rice ecotype 9522" was used as material in this experiment, and 20 seedlings survived after gene editing. 8 positive plants, 6 homozygous mutations and 2 heterozygous mutations were identified. The amino acid structure of mutant JAZ6 was changed. In the result of phenotypic identification, the spikelets and stamens of mutant plants did not develop normally, It means that JAZ6 gene is involved in the process of flower organ formation in rice.
Key word：rice、jasmonates、JAZ6、CRISPER/Cas9、Floral organ development
目 录
1.引言 4
1.1 茉莉素信号途径 4
1.1.1 茉莉素的生物学功能 4
1.1.2 茉莉素信号转导 5
1.2 JAZ蛋白的研究进展 6
1.3 基因编辑常用方法 7
1.3.1 锌指核酸酶（ZFN） 7
1.3.2 转录因子效应物核酸酶（TALEN） 8
1.3.3 CRSIPER/cas9系统 9
1.4 研究的目的及意义 10
1.5 论文研究的技术流程 11
2 材料与方法 11
2.1 实验所用的水稻品种 11
2.2 实验仪器及试剂 12
2.2.1 实验仪器 12
2.2.2 实验试剂 13
2.3 实验方法 13
2.3.1 基因组靶点及引物设计 13
2.3.2 载体的构建 14
2.3.3 水稻组织培养 14
2.3.4 水稻的遗传及转化 14
2.3.5 CTAB法提取转基因水稻DNA 15
2.3.6 转基因植株阳性PCR测序鉴定 15
2.3.7 转基因植株阳性鉴定序列比对 15
2.3.8 突变植株氨基酸序列分析 16
3 结果与分析 16
3.1 载体的构建 16
3.2 水稻的遗传转化 16
3.3 阳性转基因植株的筛选 16
3.3.1 转基因植株DNA提取品质鉴定 16
3.3.2 转JAZ6基因植株的PCR扩增 17
3.3.3 转基因植株JAZ6基因的测序及比对 17
3.3.4 转基因植株氨基酸分析 18
3.4 转基因植株花器官的表型鉴定 19
结论 21
致谢 25
1.引言
水稻不仅是世界上历史最悠久，同时也是食用人口最多的粮食作物，世界上有半数人口都是以稻米为主食。水稻作为中国的第一大粮食作物，每年的水稻产量占全国粮食总产量约45%，在中国拥有举足轻重的地位[1, 2]。因此，水稻成为了科研上的重点研究对象。
在水稻的生长发育、抗逆、繁殖等过程中，植物激素起着非常重要的调控作用。常见的植物激素有生长素、赤霉素、细胞分裂素、乙烯和脱落酸。随着研究者们对植物激素的深入研究，茉莉素这一类植物内源激素逐渐被人们所了解，人们对它的信号转导途径及其生物学功能有了越来越多的认识。在水稻的生长发育和免疫胁迫的过程中，茉莉素具有非常重要的调控作用。
1.1 茉莉素信号途径
1.1.1 茉莉素的生物学功能
茉莉素( Jasmonic acid ,JA )指的是一类植物内源激素，它包含了所有来自羟基（ oxylipin ）并具有环戊烷酮结构的植物激素[3]，图1为常见的几种茉莉素分子。
图1 茉莉素分子结构图
A:茉莉酸甲酯、B:茉莉酸、C:茉莉酸异亮氨酸配合物、D:12-氧-植物二烯酸、E:cis-jasmone
人类在茉莉属素馨花的香精油中首次发现了茉莉素并提取出了MeJA。随后的几十年里，人们在菌类、植物体内发现了越来越多的类似化合物，并将其归类为茉莉素。在植物中，JA 信号是普遍存在的，当植物生长发育到一定阶段，或者受到物理、化学或者生物胁迫时，JA途径上的基因都会被激活并表达，对植物进行保护作用或者调控植物的生长发育[4, 5]。如今人们所了解的茉莉素功能有以下几个方面：
（1）茉莉素可以促进叶片的衰老[6]，很多实验研究表明，被茉莉素处理过的叶片，叶片叶绿素含量会减少，因此导致叶片黄化[7]。
（2）促进植物果实的成熟和种子萌发，推测原因可能是茉莉素可以诱导乙烯合成酶的产生，因此来促进果实的成熟，如苹果、番茄等[8]。
（3）促进水稻颖花的开放，在 JA 途径中，MYB21 和 MYB24 是两个被抑制的转录因子，当植物生长发育到一定阶段时，通过JA途径它们被释放转录表达来控制着水稻雄蕊和花粉的发育[9]。
（4）协抗生物胁迫，当植物受到害虫侵害时或其他物理或化学，JA可以诱导植物抗虫基因的表达，产生特异的茉莉酸类诱导蛋白（Jasmonates Induced Proteins，JIPs）来有效的启动植物的防御系统[10]。不仅如此，MeJA 还是具有挥发性的化合物，它的气味可以有效帮助植物来减少害虫的入侵[11]。
（5）协抗自然胁迫，研究表明，在低温环境下，植物体内的 MeJA 会作为渗透调节剂通过抑制活性氧的产生速率、保护膜的完整性来维持植物正常的新陈代谢 [12]。
1.1.2 茉莉素信号转导
JA 信号的转导需要多个基因和蛋白的协同，其中最关键的三个组分是 COI1、JAZs 和 MYC2。
在早期植物体内，JAZ 基因编码的 JAZ 蛋白（JAZs）作为一个负调控蛋白因子，它会与 MYC2 等其他转录因子相结合，从而抑制转录因子的活性[13]。而 COI1 基因可以编码一个包含 F-BOX 结构域的蛋白， F-BOX 蛋白可以与其他蛋白形成 SCFCOI1 复合体[14]。当植物生长发育到一定阶段或者受到外界胁迫作用时，植物体内高浓度的JA会给予 SCFCOI1 复合体信号，使 SCFCOI1复合体与 JAZ 蛋白结合并使 JAZ 蛋白泛素化，泛素化的 JAZ 蛋白会被 26S 蛋白酶体选择性识别并降解[15, 16]。当JAZ蛋白降解之后，被JAZ蛋白抑制的转录因子得以释放并转录激活下游基因的表达[17]（图2），当植物体内JA途径发生时，同时JAZs也会被诱导再次抑制 MYC2 的转录活性，帮助植物节省体内能量[18]。MYC2 转录因子可以响应多个基因的表达，它与植物激素应答、植物抗逆等密切相关[19]。
图2 JA信号转导途径
植物生长早期时，JA 含量很低，JAZ 蛋白会与一些转录因子结合并抑制它们的活性，COl1 基因编码的蛋白会与其他化合物组成 SCFcol1 复合体，当植物生长发育到一定阶段或遇到自然、生物胁迫时， SCFcol1 复合体会接受 JA 信号结合 JAZ 蛋白，并通过 26S 酶途径降解 JAZ 蛋白，从而释放 MYC2 等转录因子激活下游基因的表达
1.2 JAZ蛋白的研究进展
JAZs 是植物特有的 TIFY 家族一员，目前，人们从拟南芥中分离鉴定出来的 JAZ 成员共有12位，其成员都具有 NT、ZIM 和 Jas 三个保守结构域[20]。ZIM 结构域一般位于 JAZ蛋白的中间并含有28个氨基酸，在近N末端侧含有 TIFY motif ，在 C 末端侧有2个不变的丙氨酸[21]。JAS 结构域靠近 JAZ 蛋白的 C 端，这段区域在JAZ蛋白家族成员间极度保守，其中10个氨基酸相同或者是保守替换[22]，结构如图3所示：
图3 JAZs结构图
JAZs结构域（JAZs由N末端的NT、ZIM和C末端的Jas三个结构域组成，其中ZIM结构域具有保守的TIFY基序，Jas结构域具有核定位信号）
经研究发现，JAZ 蛋白不单单在JA信号中扮演着转录抑制子的身份，它还会与其他调控因子互相作用，影响着许多的信号通路和植物的生长发育过程[23]。在水稻生长发育过程中，JAZs 起到的重要作用被人们逐渐了解。如 JAZ10 基因的超表达时，水稻抗盐性和抗干旱性及稻米的大小都有所增加，[24]。
我们通过酵母筛选发现，JAZ1 蛋白与JAZ6 蛋白可以通过 ZIM 结构域互作(图4)，经吴华等人的研究发现，JAZ1 蛋白在植物JA途径中起重要功能，它可以结合并抑制转录因子，在 JA 途径中被 SCFcol1 识别并通过 26S 蛋白酶途径降解[25]。而与 JAZ1 蛋白互作的 JAZ6蛋白是否在 JA 途径中同样扮演着转录抑制子的身份，又或者具有其他功能尚且不明。
图4 JAZ1 与JAZ6 通过 ZIM 结构域互作
1.3 基因编辑常用方法
1.3.1 锌指核酸酶（ZFN）
锌指核酸酶（zinc finger nuclerses,ZFNs）是第一代人工合成酶，它是由锌指蛋白和核酸内切酶 Fok I 的 C 端核酸剪切结构域组成的融合蛋白[26]。Fok I 是一种限制性内切酶，可以识别 GGATG 位点，它的特点是形成二聚体后才具有酶切活性，而且即使与其他蛋白组成融合蛋白也依旧具有剪切功能。这些特点使它很好成为了基因编辑工具[27]。
一个ZENs单体由三个串联的锌指蛋白单元与一个 Fok I 组成，它可以识别特定的位点，当两个识别位点相距距离合适时，两个Fok I 便可以形成二聚体对基因进行切割(图5）。每个锌指蛋白单元可以特异性识别三个核苷酸碱基，当 Fok I 形成二聚体之后，ZENs便可以特异性识别18个碱基位点[28]。ZFNs 技术虽然慢慢成熟，但是脱靶与细胞毒性两个问题一直没有得到有效解决[29]。并且在植物的应用中有许多限制条件。同时 ZFNs 在设计、筛选与验证上需要花费很多的时间与精力，因此，该技术的广泛推广还需要一定的时间。
1.3.2 转录因子效应物核酸酶（TALEN）
图5 锌指核酸酶原理
a 两个Fok I形成二聚体
b ZFNs将结合位点的DNA切开
（图片引自张春光，,2015）
转录因子效应物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）是继 ZFNs 后出现的基因编辑技术，与 ZFN 相比，TALEN 对基因编辑修饰的特异性更高且构建简单很多[30]。它是由特异性 DNA 结合结构域 TALE 和 DNA 切割结构域 Fok I 核酸内切酶两部分组成,编辑的原理也是利用 Fok I 二聚体将序列切割。
TALE是由转运信号、核定位信号、转录激活结构域和 DNA 特异性识别结构域四个部分组成[31]，DNA 特异性识别结构域是一段高度保守的同源重复序列。每个序列对应识别一个碱基，共能识别33~35个氨基酸，其中第12和13氨基酸为重复序列可变的双氨基酸残基( repeat variable diresidues，RVD)。TALE也便是依靠 RVD 来识别基因序列。在RVD中，HD 可以识别胞嘧啶、NG 可以识别胸腺嘧啶、NH 可以识别鸟嘌呤、NI 可以识别腺嘌呤。NS 则可以识别任意碱基[32]。在工作原理上，TALEN 与 ZFN 大体相似。我们只需要设计一对 TALEN ,让 TALE 在靶点序列识别结合，利用 Fok Ⅰ 的 剪切功能来对基因进行编辑[33]（图6）。
与 ZFN 相比，TALEN 的构建更加简单，脱靶效应与细胞毒作用更低，但是同样 TALEN 也具有其局限性，TALE 分子的组装十分繁琐、测序工作大，普通实验室难以操作，一般将工作交于生物公司，成本较高。选择多个基因同时打靶时，TALEN 的转染效率低，因此获得阳性植株数量较少，导致工作量较大[34]。
图6 TALEN的工作原理
TALEN包含DNA识别域和 Fok I 域，并通过 Fok I 形成二聚体进行DNA编辑（图片引自胡小丹，基因编辑技术，2018）
1.3.3 CRSIPER/cas9系统
CRISPER/cas9 系统是最新出现的第三代基因定点编辑技术。与 ZFN、TALEN 技术相比，CRISPER/cas9 系统具有低成本、高效性、高特异性和易操作等优点，成为了如今基因定点编辑的主流技术[35]。
早在1987年，科学家们便在大肠杆菌的基因组上发现了一段成簇规律间隔短回文重复序列[36]，随着研究发现，这种回文重复结构在细菌和古菌中广泛存在。2002年，研究人员将这种结构正式定义为 clustered reguiatory interspaced short palindromic repeats（CRISPR）[37]。
后面研究发现，CRISPER/cas9 是一种广泛存在于细菌和古菌中的适应性免疫防御机制。它可以有效的帮助细菌降解外源病毒和质粒[38]。该系统主要由 CRISPR 序列和编码Cas蛋白的基因座组成。CRISPR 序列由前导序列(leader)、重复序列(repeat)和独特的间隔序列(spacer)组成，CRISPR 序列加工成熟产生 crRNA，crRNA 与 tracrRNA 形成嵌合体识别靶位点附近的PAM(protospacer adjacent motif)区，然后引导cas基因表达的核酸内切酶结合特定基因组序列从而进行切割。
根据核酸酶不同的识别和切割机制，CRISPER/cas 系统被分为了Ⅰ-Ⅵ型[39]。目前被广泛使用的 CRISPER/cas9 系统是来自化脓型链球菌的II型系统。如今 CRISPER/cas9 系统经简化之后，主要由 cas9 蛋白和向导 RNA（single guide RNA，sgRNA）两部分组成。
sgRNA 由特定的crRNA序列和反式作用 RNA(trans-activating,crRNA)两部分组成（图7-A）。它可以通过与基因上的靶位点结合来引导 Cas9 蛋白识别 PAM ( protospacer adjacent motif)序列（图7-B）。然后 cas9 蛋白发挥核酸内切酶的功能，在目标DNA双链的PAM区进行切割造成DNA双链断裂[40]（图7-C）。水稻自身的DNA损伤修复机制会修复断裂的双链，当其修复发生错误时，便会在切割位点处造成突变[41]（图7-D）。
图7 Crisper/cas9系统的作用机制
1.4 研究的目的及意义
如今，人们对茉莉素的研究已经从简单的生理功能深入到了其转导机制和相关蛋白的研究，JAZs 的研究发现加速了人们对植物体内 JA 途径的探索，JA 途径的信号转导机制慢慢被人们摸索清楚。然而 JAZ 家族成员之间功能各异，在不同植物体内具有着不同的功能和表现，对 JAZs 成员的功能鉴定已经成为了人们研究的一大重点。了解 JAZs 各个成员参与调控的信号途径对了解植物中的激素调控网络、认识植物的生长发育和抗逆过程具有重要意义。
我们利用 CRISPER/cas9 系统来对水稻JAZ6基因进行定向编辑，经编辑之后的水稻愈伤培养至成熟水稻，取其叶片进行 DNA 鉴定，从鉴定结果中筛选出阳性植株。阳性植株 JAZ6 基因在水稻生长过程中可能会出现弱表达或者不表达现象，通过对阳性植株的表型进行鉴定，根据其表型来确定 JAZ6 基因在水稻的生长发育过程中的表现与功能。
这次实验我们采用的的 CRISPER/cas9 系统是一种新型的基因编辑技术。这次实验不仅可以探究 JAZ6 的功能，它还为以后利用 CRISPER/cas9 系统去编辑其他重要基因提供了一套成效良好的实验体系，有助于研究者们对其他重要基因进行功能探索。
传统育种技术往往是依赖于生物个体水平上的有性杂交，获得一个优良性状品种往往需要十几年的时间，通过几个世代的反复正交与反交来获得。在这次实验中，我们利用的 CRISPER/cas9 系统可以帮助我们很快得到突变植株，虽然 CRISPER/cas9系统 利用的是转基因原理，但是它是在改变植株原 DNA 序列的基础上来获取突变植株，实验中使用的标记基因也可以通过回交来剔除，获得的品种将不含有外源基因。因此利用 CRISPER/cas9系统去培育新出品种在推广上无疑会使百姓更加放心。毫无疑问，合理使用 CRISPER/cas9系统一定将是水稻育种上的一种新的快捷有效的途径。
1.5 论文研究的技术流程
我们利用了上海交通大学生命科学学院成熟的CRISPER/cas9系统实验体系，设计了如下实验流程：
图8实验设计流程
2 材料与方法
2.1 实验所用的水稻品种
实验所选用实验材料为水稻品种“粳稻生态型9522”(Oryza sativa L.subsp. japonica,‘武运粳7号’)，为1999年南方稻区水稻品种区试的优良品种。培育者为江苏武进市农科所，可在长江流域粳稻区作单、双季种植。
2.2 实验仪器及试剂
2.2.1 实验仪器
仪器 | 公司/品牌 |
基因扩增仪 | S1000TM Thermal Cycler |
电泳仪 | Tanon |
凝胶成像系统 | Tanon-3500 |
SimpliNano 分光光度计 | Thermo |
普通离心机 | Thermo |
DH-S24型离心机 | Eppendorf |
4℃冰箱、-20℃冰箱 | Haier |
-70℃冰箱 | Thermo |
洁净工作台 | 上海博讯有限公司医疗设备厂 |
DNP-9082型电热恒温培养箱 | 上海精宏实验设备有限公司 |
DDHZ-300恒温振荡器 | 江苏太仓市实验设备厂 |
DZF-6050型真空干燥箱 | 上海精宏实验设备有限公司 |
YXQ-LS-S-Ⅱ压力蒸汽灭菌锅 | 上海博讯有限公司医疗设备厂 |
FM 70A制冰机 | GRANT,UK |
SZ-93自动双重纯水蒸馏器 | 上海亚荣生化仪器厂 |
2.2.2 实验试剂
试剂 | 公司 |
Taq 酶、BsaI酶 | |
dNTP | 上海碧云天生物技术有限公司 |
DNA回收纯化试剂盒 | TaKaRa公司 |
质粒小提试剂盒 | TIANGEN |
核酸染料 | 生工生物工程（上海）股份有限公司 |
潮霉素（Hyg）、卡那霉素（kan）、谷氨酰胺 水解酪蛋白、植物激素（2，4D、6BA等） | Sigma公司 |
琼脂 | 优宁维生物 |
琼脂糖 | 萨恩化学技术（上海）有限公司 |
乙醇,氯仿,异戊醇, 氯仿等化合物 | 上海国药集团化学试剂有限公司 |
2.3 实验方法
2.3.1 基因组靶点及引物设计
实验共选择了四个靶点，靶点的选择首先使用在线软件CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/) 做脱靶分析 ,输入OsJAZ6序列进行分析,选取分值较高的靶点位点,避免产生脱靶效应；然后使用 RNA Folding Form 软件(http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form2.3)分析靶点序列和sgRNA序列间的二级结构,避免靶序列与 sgRNA序列产生可配对的二级结构；筛选 GC 含量在50%~70%、靶点序列内不存在连续4个T的20bp靶序列,去掉5′端第一个碱基，然后连接酶切位点接头。实验中共合成了三对引物，引物为 OsJAZ6-1-F 和 OsJAZ6-1-R、OsJAZ6-2-F 和 OsJAZ6-2-R。引物的合成由上海捷瑞生物有限公司完成。
表1 引物的名称、序列及作用
引物名称 | 引物作用 | 引物序列（5’-3’） | 对应靶点 | |
OsJAZ6 -1-F | 正向引物 | CTCCCCTAGGAAGGTTTCCG | GGTGAAGCCGATGCGAACAAGGG | |
OsJAZ6 -1-R | 反向引物 | TCCACACTACCTACCAACCACT | ||
OsJAZ6 -2-F | 正向引物 | ATATGCGTAGATGGCGGGTG | CCGTTGCCGACAACACTAAGGTG | |
OsJAZ6 -2-R | 反向引物 | TCATTGGCTCGATTCCTG | ||
2.3.2 载体的构建
实验中CRISPR/Cas9系统选用的启动子为水稻来源的U3和Ubi，使用的载体为pBin-sgR-Cas-OsJAZ6。首先，使用酶切法将引物连接载体。随后,将5~10μL连接产物按《分子克隆实验指南》所述步骤转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。鉴定正确的质粒进一步按《分子克隆实验指南》所述步骤热激法转化EHA105农杆菌感受态。再取单菌落扩繁进行菌液PCR鉴定,取阳性菌液用于转化水稻愈伤组织[42]。
2.3.3 水稻组织培养
培养水稻愈伤所需试剂为：75%乙醇、33% NaClO、灭菌水。水稻愈伤培养步骤如下：
首先挑选品质较好的干种子并去壳，接着将去壳后的种子带入无菌室，实验人员双手及超净台酒精棉灭菌，准备实验用75%酒精浸泡去壳后的种子消毒一至两分钟，再用33.3% NaClO 摇床浸泡三十分钟，最后用无菌水清洗10—20次,清洗至无异味为止。倒出种子于滤纸上晾干，放入NBD2培养基，每块平板放入约20个种子，密封后放置26℃环境下暗培养8—10天[43]。当黄色愈伤组织在胚轴出现时，切除根部和胚乳，将胚轴转移至新鲜培养基上，培养10天后转化；
2.3.4 水稻的遗传及转化
实验使用的转化方法为农杆菌介导的水稻遗传转化。准备工作有无菌离心管、无菌滤纸、YEB液体培养基、AAM-AS(AS浓度200μL/L)液体培养基、NBD2-AS固体培养基；
具体实验步骤如下：挑去农杆菌单菌落，在100ml加抗生素的YEB培养基中震荡约16小时（200rpm,28℃），至OD600为0.6-0.8；3000rpm离心10分钟，在AAM-AS（AS浓度200um/L）液体培养基中重悬沉淀至浓度OD600为0.6-0.8；将带有黄色愈伤的胚从培养基中挑出，将其浸泡在细胞悬液中20分钟，封口放置摇床震荡20-30分钟；每块平板放置2张无菌滤纸，收集悬液中浸泡的愈伤并放置在平板中滤纸上，吸干水分；在NBD2-AS（AS浓度为100uM/L）培养基平板表面放上2张无菌滤纸，把胚放在滤纸表面，28℃暗培养三天，三天后转R1培养基；R1暗培养12天后，把胚的根部去掉，把胚放入NBD2培养基平板上，培养基中事先加入潮霉素40mg/L，头孢400mg/L，羧卞200mg/L，28℃暗培养12天。暗培养12天后，再转入新鲜的NBD2培养基平板上，培养基中事先加入潮霉素40mg/L，头孢400mg/L,28℃暗培养12天，在这个时间能看见新的愈伤长出；把愈伤放在分化培养基MS-H培养基平板上，加潮霉素25mg/L，28℃（24小时光照）培养；当绿芽出现，立即把它们转入新鲜的MS-H培养基（平板或塑料瓶）内，加潮霉素25mg/L,新的无根苗在十天内形成；将无根苗移入再生培养基MSNH上，诱导根的形成；当根形成后，把苗移入温室换用营养液培养；
2.3.5 CTAB法提取转基因水稻DNA
配置1.5×CTAB溶液（1L，PH=8）用于提取水稻DNA，溶液配制方法为 CTAB 15g、1mol Tris-Hcl (PH调至8.0)75ml、0.5mol EDTA（PH调至8.0）30ml、NaCl 61.36g。
提取水稻核酸，步骤如下：取0.2—0.3克水稻于2ml EP 管中，放置烘箱烘干叶片水分；放入三枚钢珠，用研磨机研磨成粉末；加入1.5×CTAB溶液700μL，60℃烘箱或水浴处理三十分钟，期间颠倒混匀三到四次，以充分裂解细胞壁；加入700μL氯仿，震荡混匀后离心，13000rpm,1Omin；吸取上清500μL于新管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置20分钟以上；离心，13000rpm,10min。倒掉溶液，留下DNA沉淀；加入70%的酒精1mL，弹起沉淀洗涤后离心,13000rpm,10min。倒掉溶液，留下DNA沉淀，再洗涤一次，晾干；用50μL ddH2O溶解DNA，放置-20℃冰箱保存[44]；
利用 SimpliNano 分光光度计来检测水溶液中核酸浓度及 260/280 比值，鉴定所提取水稻植株的DNA品质。
2.3.6 转基因植株阳性PCR测序鉴定
利用 PCR（聚合酶链式反应）技术对目的片段进行扩增，扩增体系体系为20μL，由2μL DNTP、2μL Mg2 buffer、正向引物和反向引物各0.5μL、耐热DNA聚合同酶（Taq）0.5μL、DNA模板2μL、ddH2O 12.5μL组成。PCR反应条件为94℃预变性5分钟；32个循环94℃高温变性30秒、54—60℃低温退火30秒、72℃适温延伸；最后72℃完全延伸5分钟[45]；
使用1.5%凝胶电泳的方法来检测PCR体外扩增是否成功，电泳TBE溶液浓度为0.5%,点样体系为2μL核酸染料及5μL PCR产物，电压180V，跑胶时间约为15min[46]。最后使用凝胶成像系统进行拍照保存。
2.3.7 转基因植株阳性鉴定序列比对
吸取PCR产物15μL与测序引物（测序引物为扩增所使用引物）5μL 送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序；通过软件ChromasPro,将目的基因的CDS序列与反馈结果序列相比对。根据峰图读写出转基因植株DNA序列，再与JAZ6原基因序列做对比，确定是否突变及突变类型。
2.3.8突变植株氨基酸序列分析
我们利用软件DNAman来分析突变植株的氨基酸序列，输入阳性植株的突变DNA序列，使用DNAman翻译功能，分析出其氨基酸序列，再与原氨基酸序列进行对比，便可以得出其氨基酸序列变化情况。
3 结果与分析
3.1 载体的构建
在CRISPER系统中，Cas9载体在所有的敲出体系中都是通用的，而sgRNA是根据不同基因而设计，设计好的sgRNA与Cas9蛋白载体的连接方式如下所示。
图9 载体的结构图
pOsU3为启动sgRNA转录的启动子；pOsUbi为水稻ubiquitin的启动子，用于启动Cas9蛋白转录；NSL为核定位序列；35S为启动抗性基因转录的烟草35S启动子；H 为潮霉素抗性基因；K 为卡那霉素抗性基因
3.2 水稻的遗传转化
实验通过农杆菌介导的遗传转化法，成功将载体pBin-sgR-Cas-OsJAZ6转入水稻愈伤组织中。接着对侵染过的水稻愈伤组织进行继代和分化和生根培养，最终转入组培间成活的转基因水稻植株共有20株。
3.3 阳性转基因植株的筛选
3.3.1 转基因植株DNA提取品质鉴定
共提取20个转基因水稻株系的DNA，依次编号为1-20。使用SimpliNano 分光光度计对提取的转基因水稻DNA进行浓度值(μg/μL)及OD260/280比值测定。表2列出部分转基因水稻DNA的鉴定结果，从表2可以看出所提取DNA的品质良好，蛋白及RNA污染较小，浓度适宜可以进行体外扩增。
表2转基因水稻DNA的品质鉴定
编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
浓度 | 1.25 | 1.28 | 1.79 | 3.2 | 1.39 | 1.08 | 1.57 | 0.84 | 0.28 | 1.89 |
OD260/280 | 1.978 | 1.983 | 1.955 | 2.029 | 1.957 | 2.07 | 1.96 | 2.01 | 1.983 | 1.957 |
3.3.2转JAZ6基因植株的PCR扩增
以提取的水稻DNA为材料，利用PCR仪对JAZ6基因片段进行体外扩增，扩增引物分别为OsJAZ6-2-F 和 OsJAZ6-2-R、OsJAZ6-2-F 和 OsJAZ6-2-R。图10-a为靶点a DNA扩增片段电泳图，图10-b为靶点b出 DNA扩增片段电泳图，利用引物所扩增的DNA片段长度预期大小分别为358 bp及412 bp。，从图10可以看出PCR产物条带明亮单一。但图10-b中2号扩增产物片段长度与目的片段大小不符，可能由胶板密度不均所造成。对其进行二次电泳，检测结果良好，产物片段大小正常，所有扩增产物送往测序公司进行测序分析。
图10-a 靶点a处DNA片段的PCR扩增
图10-b 靶点b处DNA片段的PCR扩增
3.3.3 转基因植株JAZ6基因的测序及比对
根据桑尼测序公司反馈的DNA序列与原基因序列进行对比，在靶点a处发生突变的突变株编号为JAZ6-1-*，在靶点b出发生突变的突变株编号为JAZ6-2-*。突变株DNA见表3，在鉴定的20棵株系中，在靶点a发生突变的植株有4,株，JAZ6-1-7和JAZ6-1-8发生了纯合等位突变，在两条链的相同位置均缺失了碱基。JAZ6-1-9与JAZ6-1-17发生了杂合突变，在他们的DNA序列中，一条链缺失了3bp碱基，另一条链未突变。在靶点b出发生突变的植株为4棵，分别为JAZ6-2-7、JAZ6-2-8、JAZ6-2-10和JAZ6-2-17。他们都发生了纯合突变。JAZ6-2-7与JAZ6-3-8突变情况相同，一条链缺失一个C碱基，一条链增添一个T碱基；JAZ6-2-10一条链增添一个A碱基，一条链增添一个T碱基；JAZ6-2-17一条链增添了一个A碱基，另一条链增添了AG两个bp碱基。
表3转基因突变植株DNA序列的鉴定
突变植株 | DNA序列 | 缺失 | 增添 | 错位 |
JAZ6-1-7* | ……GAGGTGAAGCCGATGC...CAAGGGG…… | 3 | ||
JAZ6-1-8* | ……GAGGTGAAGCCGATGC...CAAGGGG…… | 3 | ||
JAZ6-1-9 | ……GAGGTGAAGCCGATGC...CAAGGGG…… | 3 | ||
未突变 | ||||
JAZ6-1-17 | ……GAGGTGAAGCCGATGCGAA...GGGG…… | 3 | ||
未突变 | ||||
JAZ6-2-7 | ……TGCAACCGTTGC.GACAACACTAAGG…… | 1 | ||
……TGCAACCGTTGTCCGACAACACTAAG…… | 1 | |||
JAZ6-2-8 | ……TGCAACCGTTGC.GACAACACTAAGG…… | 1 | ||
……TGCAACCGTTGTCCGACAACACTAAGT…… | 1 | |||
JAZ6-2-10 | ……TGCAACCGTTGACCGACAACACTAAGT…… | 1 | ||
……TGCAACCGTTGTCCGACAACACTAAGT…… | 1 | |||
JAZ6-2-17 | ……TGCAACCGTTGACCGACAACACTAAGT…… | |||
……TGCAACCGTTGAGCGACAACACTAAGT…… | 1 | 1 |
植株编号中*表示纯合等位突变，省略号前后代表DNA序列相同
3.3.4 转基因植株氨基酸分析
利用软件DNAman对突变株的DNA序列进行氨基酸分析，突变株JAZ6-1-7、JAZ6-1-8两条链在翻译中缺少了N氨基酸，JAZ6-1-9和JAZ6-1-17一条链翻译正常，一条链缺失N氨基酸。与原氨基酸序列相比，它们的突变情形较弱。而JAZ6-2-7、JAZ6-2-8、JAZ6-2-10和JAZ6-2-17的氨基酸都发生了很大的改变，增添的碱基使氨基酸翻译发生了提前终止，在JAZ6-2-7、JAZ6-2-8的一条链中，氨基酸结构发生了很大变化，突变靶点之后的氨基酸序列与原序列完全不同；表4为突变株氨基酸分析结果汇总。
表4 突变植株氨基酸序列分析结果
突变植株 | 氨基酸序列 | 突变结果 |
JAZ6-1-7* | ……GELGLGIRGEADA·KGKETMELFPQ…… | 缺失一个N氨基酸 |
JAZ6-1-8* | ……GELGLGIRGEADA·KGKETMELFPQ…… | 缺失一个N氨基酸 |
JAZ6-1-9 | ……GELGLGIRGEADA·KGKETMELFPQ…… | 缺失一个N氨基酸 |
未突变 | ||
JAZ6-1-17 | ……GELGLGIRGEADA·KGKETMELFPQ…… | 缺失一个N氨基酸 |
未突变 | ||
JAZ6-2-7 | ……RLKHPTRVPLQMLLRSRRSCRRVSHGLG* | 翻译提前终止 |
……QMASKSSSTAQNCVLLPSSATATVVRQH* | 翻译提前终止 | |
JAZ6-2-8 | ……RLKHPTRVPLQMLLRSRRSCRRVSHGLG* | 翻译提前终止 |
……QMASKSSSTAQNCVLLPSSATATVVRQH* | 翻译提前终止 | |
JAZ6-2-10 | ……ASKSSSTAQNCVLLPSSATATVDRQH* | 翻译提前终止 |
……QMASKSSSTAQNCVLLPSSATATVVRQH* | 翻译提前终止 | |
JAZ6-2-17 | ……ASKSSSTAQNCVLLPSSATATVDRQH* | 翻译提前终止 |
……ASKSSSTAQNCVLLPSSATATVERQH* | 翻译提前终止 |
植株编号中*表示纯合等位突变，省略号前后代表氨基酸序列相同，加粗代表氨基酸序列与原先序列完全不同,氨基酸序列中*代表终止子
3.4 转基因植株花器官的表型鉴定
利用光学显微镜对野生型花器官与筛选出来的两株突变株（分别命名为eg2和OsJAZ6-OE）花器官进行扫描拍照对比。从图11-E、F、G三张图中可以看出，eg2与野生型相比，雄蕊发育不良，雌蕊未正常发育。从图11-J、K、L三张图与野生型（WT）相比可以看出，OsJAZ6-OE的不育外稃未正常发育，雄蕊与雌蕊弯曲且发育不良。
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