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摘 要

茯苓多糖是一种具有高药理价值的活性成分，主要通过茯苓子实体的提取获取，从而限制了茯苓多糖的应用，利用茯苓液体发酵制备茯苓多糖成为了目前研究的热点。本文主要对茯苓液体发酵的培养基组分进行优化。首先，研究了茯苓发酵培养基中的最适碳源与氮源，以单因素法探究最适的碳氮源种类，得到最优氮源为大豆蛋白与酵母浸出粉的混合氮源，而最适碳源为葡萄糖，之后通过SAS响应面优化碳氮的最适浓度，最终得出茯苓液体发酵的最适发酵培养基为：葡萄糖 5%，酵母浸膏 1.5%，蛋白胨 0.5%，多糖产量达到1245mg/L，产量较未优化提高了2倍。本论文研究结果可为茯苓多糖的高效生产提供一定的技术支持。

关键词：茯苓；液体发酵；优化；多糖；培养基

Abstract: Poria cocos polysaccharide is a kind of active ingredients with high pharmacological value, mainly through the extraction of poria cocos fruiting body, limiting the application of poria cocos, use of poria cocos fermented liquid preparation of poria cocos polysaccharides become the focus of the present study. In this paper, the medium components of the liquid fermentation of poria cocos were optimized. First, poria cocos were studied the optimal fermentation medium carbon source and nitrogen source, by single factor method to explore the optimal carbon and nitrogen source types, to get the optimal nitrogen source for leaching soy protein and yeast powder mixed nitrogen source, and the optimum carbon source is glucose, after by SAS, the response surface optimization optimal concentrations of carbon and nitrogen, finally it is concluded that the optimal fermentation poria cocos liquid fermentation culture medium for: 5% glucose, 1.5% yeast extract, peptone 0.5%, polysaccharide production reached 1245 mg/L, increased production was not optimized 2 times. The results of this paper can provide some technical support for efficient production of poria cocos.

Keywords: Poria cocos. ;Liquid fermentation; Optimize ;Polysaccharides; Medium

目 录

1. 前 言 5

1.1 茯苓及其药理作用 5

1.2 茯苓的生产现状 5

1.3 药用真菌发酵研究的现状 6

1.4研究思路 7

2.材料与方法 8

2.1 材料 8

2.1.1 菌种 8

2.1.2 试剂 8

2.1.3 溶液 9

2.1.4 培养基 9

2.1.5 仪器设备 9

2.2 方法 9

2.2.1培养基的配置与接种 9

2.2.2多糖的提取 10

2.2.3多糖含量测定方法 10

2.3茯苓多糖发酵培养基中碳氮源的优化 11

2.3.1氮源种类的优化 11

2.3.2 碳源种类的优化 12

2.3.3 响应面法优化 12

3. 结果与分析 14

3.1茯苓多糖发酵培养基氮源的选择 14

3.2茯苓多糖发酵培养基碳源的选择 15

3.3响应曲面法优化 16

3.4小结 19

4讨论 20

4.1 培养基组成优化的讨论 20

4.2茯苓多糖的提取以及测定方法的讨论 20

5. 结论与展望 22

5.1 结论 22

5.2 展望 22

致谢 23

参考文献 24

1. 前 言

1.1 茯苓及其药理作用

茯苓，别名为白茯苓、云苓或者伏菟，是一种寄生在赤松或者马尾松等松科植物上的多孔菌科植物。茯苓是我国的传统中药，历史悠久，长达千年，自古以来人们就非常喜爱茯苓，在《神农本草经》中就已经出现了有关茯苓的记载，认为它是一种美味的食补佳品。中医认为其拥有安神养魂，利脾健胃，利水利尿，延年益寿的功效，可缓解失眠，心悸等症状^[1]。

现代医药学研究结果表明茯苓含有茯苓多糖，茯苓酸，三萜化合物以及松苓酸等成分，其中，茯苓多糖的含量高达 84.2%，是茯苓的主要成分。茯苓多糖是天然活性物质，它的细胞毒性极低^[2]，拥有抗肿瘤^[3] ，提高免疫功能以及抗氧化等作用^[4]，是茯苓中主要药理活性成分。最近，研究人员以茯苓多糖的作用为方向做了许多研究^[5]，例如Imran Khan^[6]等人以大鼠为材料探究茯苓等中药对肠道菌群的调节，从而论证茯苓对调节肥胖的作用；Yajun Wu^[7]等人从茯苓中提取出多糖PCP-II，并且发现其能通过促进脾细胞增殖从而提高接种流感疫苗的小鼠的抗原特异性抗体水平，并认为其可以作为人类和动物疫苗的有效佐剂；吕乔^[8]等就茯苓多糖的超高压萃取工艺优化及其在卷烟中的应用做了有关研究，发现其能显著增加卷烟香气量和香气质，使各香韵间的协调性较好；Ka Wu^[9]等人通过对小鼠的研究发现茯苓多糖可以通过抑制肝细胞的炎症反应和凋亡从而对肝起保护作用；Na Wang^[10]等人使用PCR和Western blot技术探究发现茯苓多糖与奥沙利铂联合可以抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力；科研人员甚至发现茯苓可以抑制黑色素的生成，具有美容功效^[11]。

1.2 茯苓的生产现状

随着国人生活水平的提高，茯苓等传统中药的需求量也大幅上涨，然而由于我国对中药的开发无度，中药资源减缩，生物多样性下降，多数药用真菌的天然资源不足，天然野生茯苓资源也极其短缺，如今只在安徽省岳西县、云南省大姚县见到^[12]，这促使了茯苓的人工生产工艺的发展。现在的茯苓生产多为人工栽培，将茯苓的菌种寄生在松木中，埋在20至30cm深土壤中繁殖生长。其中菌种多以组织分离制种，在茯苓育种中，紫外诱变菌体的原生质体，利用菌株酯酶以及同工酶等现代技术已经广泛地使用^[13]。

目前茯苓的人工栽培的流程大致为分离菌种，将菌种进行培育，把培育后的菌种袋料分装，将其置于松木窖中，任其繁殖生长，在此之间，田间需要严格的人工管理，以维持田间的湿度及温度等要素，最终得到鲜茯苓，再经过工厂的加工处理，就成为干燥的成品^[12]。由于气候及资源的限制，现在人工栽培的茯苓大多存在于云南产区、湘黔地带以及大别山地带。传统的茯苓人工栽培，茯苓的生长期长，外界环境因素对栽培的影响大，无法满足消费需求，并且造成了资源的消耗，对松木林地生态环境造成了较大的影响，并且人工栽培通常以个体农户为单位，质量难以保证，难以满足社会的需要。而液体的摇瓶发酵技术操作技术简易，生长周期比较短，获得的多糖产量大，除此之外，在发酵培养的过程中，除了菌丝体的大量增殖，茯苓细胞还会产生多糖，氨基酸等次级代谢产物，他们具有许多药理活性^[14]。故而，药用真菌的液体发酵成为药用真菌生产研究的一个重要方向。

1.3 药用真菌发酵研究的现状

现在已知的药用真菌大多为子囊菌亚门与担子菌亚门的真菌，其中，担子菌亚门中的药用真菌种类大概占九成的药用真菌，例如冬虫夏草，茯苓，紫芝等。 药用真菌拥有很多药理作用，在农业，医药，食品等领域都有应用。近些年，由于野生真菌的过度采摘，野生的药用真菌资源过度匮乏，促使许多真菌出现人工栽培。

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