论文总字数：11115字

摘 要

本实验以100mmol/L的NaCl模拟盐胁迫环境，然后通过设置三个梯度的精胺（0.05g/L,0.075g/L,0.1g/L）探究精胺缓解盐胁迫对小麦幼苗生长的影响。结果表明在盐胁迫下小麦幼苗的生长受到抑制，且SOD、POD活性升高，超氧阴离子自由基含量升高，可溶性蛋白质含量减少，叶片相对电导率升高。在加入精胺后，小麦幼苗生长的抑制作用得到了缓解，SOD、POD活性进一步升高，清除超氧阴离子自由基的能力得到增强，可溶性蛋白含量增加和叶片细胞质膜透性降低，且0.1g/L精胺对盐胁迫下小麦幼苗的缓解效果最好。

关键字：小麦，盐胁迫，精胺，缓解作用。

Abstract: In this experiment 100 mmol/L NaCl was used to simulate the environment of salt stress, and set three gradients of spermine(spm) (0.05 g/L, 0.075 g/L, and 0.1 g/L) to investigate the effects of different content of Put on the growth of wheat seedlings under salt stress.The results showed that the growth of wheat seedlings was inhibited under salt stress，and the activities of SOD and POD were increased, the content of O₂•^- was increased, the content of soluble protein was decreased, and the plasma membrane permeability of leaf cells was increased. After the addition of Spm, the inhibition of wheat growth was alleviated, SOD, POD activity was increased, the content of soluble protein was increased and the plasma membrane permeability of leaf cells was decreased, And 0.1g/L spermine had the best alleviation effect on wheat seedlings under salt stress.

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Keywords: wheat, salt stress, spermine ,alleviation

目录

1 前言 4

1.1盐胁迫的危害 4

1.2精胺缓解盐胁迫的作用机理 4

2 材料与方法 5

2.1试验材料 5

2.2 Hoagland营养液配制 5

2.3材料培养 5

2.4 实验设计 6

2.5 测定方法 6

2.5.1 预备、酶液的制备 6

2.5.2过氧化物酶（POD）活性的测定（愈创木酚法） 7

2.5.3超氧化物岐化酶（SOD）活性的测定（氮蓝四唑光化还原法） 7

2.5.4超氧阴离子自由基含量的测定（羟胺氧化法） 8

2.5.5可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法） 8

2.5.6植物细胞质膜透性的测定（电导仪法） 9

2.6 数据分析 9

3 结果与分析 10

3.1精胺对盐胁迫下小麦幼苗株高的影响 10

3.2精胺（spm）对盐胁迫下小麦幼苗叶片POD活性的影响 11

3.3精胺（spm）对盐胁迫下小麦幼苗叶片SOD活性的影响 12

3.4精胺（spm）对盐胁迫下小麦幼苗叶片细胞质膜透性的影响 13

3.5精胺（spm）对盐胁迫下小麦幼苗叶片超氧阴离子自由基的影响 14

3.6精胺（spm）对盐胁迫下小麦幼苗叶片可溶性蛋白含量的影响 15

结论 17

致谢 19

1 前言

据联合国粮农组织（FAO）的不完全统计，全球约3419万公顷的耕地被盐渍化^[1]。土壤盐渍化是现代农业生产面临的主要问题之一。随着土地利用的不断发展和大面积的增加，土壤次生盐渍化程度不断增加，土壤盐渍化面积逐年增加，盐碱地生态环境恶化，给粮食的生产带来严重威胁。引导和制约人民生活水平的提高。

植物由于营固着生活, 面对变化的环境获得抗盐性至关重要^[2]。在盐环境中，植物常常会作出相应的反应并削弱不利因素造成的危害。植物应对措施涉及很多因素，精胺就是其中的一个最为常见的响应盐胁迫的物质^[3]。

1.1 盐胁迫的危害

盐胁迫是指植物由于生长在高盐度环境而受到的高渗透势作用的影响^[4]。土壤盐分是制约植物生长的主要因素之一^[5]，盐胁迫不仅会造成农作物品质的下降，降低产量，同时还会使土壤板结，大大降低土壤的利用率，使土地盐渍化，从而威胁到粮食的生产^[6]。对于一般的植物而言，离子平衡的失调和渗透胁迫调节能力的降低是其遭受盐害的原因。盐碱会给植物造成离子毒害、渗透胁迫和营养不平衡，引起膜脂过氧化，并能够导致细胞死亡^[7]。

1.2精胺缓解盐胁迫的作用机理

精胺是含有两个氨基和两个亚氨基的多胺类物质，在生物体内由腐胺（丁二胺）和S-腺苷蛋氨酸经多种酶催化后生成。它与亚精胺都存在于细菌和大多数动物细胞中，是促进细胞增殖的重要物质。在酸性条件下，它呈现出多阳离子多胺类特性，并能与病毒与细菌中DNA结合。使DNA分子具有更大的稳定性与柔韧性，也是细胞培养液中必要组分之一。

精胺( Spm) 参与了植物对胁迫的应答反应，能够阻止NaCl胁迫下植物叶片中叶绿素和可溶性蛋白质含量的降低，提高NaCl胁迫下根系内抗氧化酶活性，降低活性氧水平，从而提高植物对不良环境的耐受能力^[8]。

2 材料与方法

2.1试验材料

本实验材料为颗粒饱满，整齐一致的周麦22种子。

2.2 Hoagland营养液配制

将大量元素，微量元素，铁盐按照相应比例混合配制^[9]。

表1：Hoagland营养液配方

	组分	mg/L
大量Ⅰ	CaNO3·4H2O	945
大量Ⅱ	KNO3	506
	NH4NO3	80
	KH2PO4	136
	MgSO4	493
微量Ⅰ	CuSO4·5H2O	0.025
	CoCl2	0.025
微量Ⅱ	NaMoO4·2H2O	0.25
微量Ⅲ	KI	0.83
	H3BO3	6.2
	MnSO4·H2O	22.3
	ZnSO4·H2O	8,6
铁盐	FeSO4·7H2O	13.9
	ZDTA·Na	18.65

2.3材料培养

用自来水将所选择的小麦种子充分浸泡，然后将小麦种子表面的泥沙清洗干净。取铺有3层滤纸的灭菌培养皿并将洗净的种子均匀播种于其上，每皿中倒入刚好能浸润种子一半的自来水，放入25℃的黑暗恒温培养箱中催芽24h。24h后挑选露白一致的小麦均匀散布至固定于塑料盒的纱网上^[10]，往盒中加入适量自来水，使液面与塑料网齐平，置于温室中发芽4-5天，每天定时补水换水^[11]。在发芽4-5天后，挑选长势相似的小麦幼苗，用海绵包住幼苗根部并移入打有5*6个孔洞泡沫板上。置于装有每盒装有2L Hoagland营养液的塑料盒中培养，培养液的pH为5.0-6.0。将转移好的小麦幼苗置于25℃的温室中培养，培养液需要每隔三天换一次。每个处理重复三次。

2.4 实验设计

在小麦幼苗转移适应3天后，对小麦幼苗分别进行如下5种处理：（1）对照：仅使用Hoagland营养液；（2）NaCl:在Hoagland营养液中加入分析纯的NaCl,直至浓度到100mmol/L；（3）spm0.05:在用含有100mmol/L NaCl的Hoagland营养液处理的同时，加入精胺（spm)直至浓度达到0.05g/L;（4）spm0.075:在用100mmol/L NaCl的Hoagland营养液处理的同时，加入精胺（spm)直至浓度达到0.075g/L;（5）spm0.1:在用100mmol/L NaCl的Hoagland营养液处理的同时，加入精胺（spm)直至浓度达到0.1g/L。

每隔三天重新更换营养液并重复以上处理。分别在盐胁迫处理的0d、3d、6d、9d、12d后，对各组处理进行随机采样，并测定小麦幼苗的植株高度，小麦幼苗叶片的SOD、POD活性，超氧阴离子自由基含量，可溶性蛋白质的含量以及叶片相对电导率等参数。

2.5 测定方法

2.5.1 酶液的制备

酶液制备：取0.2g新鲜的小麦幼苗叶片为样品，将小麦叶片清洗干净后，剪切小块放置在预冷的研钵中，加入1.6ml预冷的0.05mol/L磷酸缓冲液PBS（pH7.8），用泡沫箱装碎冰块，并置于碎冰上研磨成匀浆，之后转移到离心管中在4℃、12000r/min下离心20min，用移液枪取出离心管中的上清液并转移至预先准备好并标记的离心管中，置于冰中保存待用。

2.5.2过氧化物酶（POD）活性的测定（愈创木酚法）

用移液枪吸取200mlPBS（0.2mol/L，pH6.0）于烧杯中和0.076ml液体（原液）愈创木酚在加热的条件下进行搅拌直至溶解，待溶液冷却后加入0.112ml 30%的 H₂O₂，充分混合均匀后制成POD反应液，保存于低温下备用。取3ml POD反应液并加入15µl酶液，以0.2mol/L的PBS为对照调零，而后测定OD₄₇₀值（测定间隔40s，测定总用时1min20s）。（测定时需要注意的是，需要加完样在五秒之内开始进行测定，如果速度慢的话，要保证每一次从加样到开始测定所间隔的时间相差不能太大，以减小误差。）。

酶活计算公式参考李合生的方法：

一个酶活单位（U）是指在每一分钟内OD₄₇₀值升高0.01为标准。

POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） （u/g min）

ΔA470：是一定时间内吸光度的改变；W是实验中所用的小麦幼苗叶片的鲜重（g）；t是反应时间（min）；Vt是利用小麦叶片获得的酶液的总体积（ml，1.6ml）；Vs是实验过程中加入的酶液体积（ml,15µl）。

2.5.3超氧化物岐化酶（SOD）活性的测定（氮蓝四唑光化还原法）

分别取甲硫氨酸溶液162ml，乙二胺四乙酸二钠溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，氯化硝基四氮唑蓝溶液6ml，核黄素溶液6ml，混合混匀后制成SOD反应液。在试管中加入3ml的SOD反应液后加15μl酶液，并将加过试剂的试管放置于4000lux光照条件的光照培养箱中，反应20min；同时准备两支对照管，分别是最大光照还原管和对照调零管，两管分别需要3ml SOD反应液加15μl（0.05mol/L）PBS和0.05mol/L的PBS。最大光还原管需照光，调零管需避光。最后在避光条件下测OD₅₆₀。（注意：本实验中所有吸光度均用北京普析通用仪器有限责任公司生产的T6新悦可见光分光光度计测得。）

SOD活性的1个酶活单位是抑制氯化硝基四氮唑蓝光化还原50%所需要的酶量。

SOD总活性=[(Ack-AE)×V]/(1/2Ack×W×Vt)

SOD总活性单位是u/g FW；Ack为最大光照还原管的吸光度；AE为添加了酶液样品管的吸光度；V为所提取得到的酶液的总体积（ml，1.6ml，加入PBS的体积）；Vt为实验测定时所加入的酶液样品的量（ml，15μl）；W为小麦样品鲜重（g，0.2g，测定时应换算为叶绿体的质量mg）。

2.5.4超氧阴离子自由基（O₂•ˉ）含量的测定（羟胺氧化法）

样品溶液的提取方法见SOD活性测定实验步骤。先取0.5ml浓度为0.05mol/L的PBS和1ml浓度为1mmol/L的盐酸羟胺溶液混匀制成预备液待用，然后将0.5ml提取液（酶液）加入预备液中充分混匀。在25℃下保存1h之后再按顺序加入17mmol/L对氨基苯磺酸和α-萘胺溶液各1ml，并立刻充分摇匀。将此试管置于25℃的保温箱中反应20min，之后再用离心机在3000×r的转速下离心3min。离心完成后，以清水为对照调零，立即取上层粉红色液相进行测定OD₅₃₀。O₂^·-含量的计算，参照高阳^[14]的方法。

2.5.5可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法）

考马斯亮蓝溶液配置：先用量筒量取50ml的90%的乙醇溶液倒入烧杯中，将利用电子天平称取的100mg的考马斯亮蓝（注意是G250）倒入其中溶解，之后缓慢加入100ml 85%（W/V）的磷酸，边加变搅拌，然后用容量瓶加入蒸馏水定容至1L，过夜后过滤，并将过滤后的考马斯亮蓝溶液保存于棕色瓶中。

样品可溶性蛋白含量测定：取一支试管加入80µl浓度为0.05mmol/L的PBS，然后用移液枪吸取20μl的提取液（酶液），最后将准备好的考马斯亮蓝溶液加2.9ml于其中。同时准备一支对照调零管，取2.9ml考马斯亮蓝加100μlPBS。在反应5-20min，待反应稳定后测定OD₅₉₅。

标准曲线的绘制：如表2所示，在各管中按顺序加入试剂，并以0号管为对照调零（BSA标准为100µg/ml牛血清蛋白标准溶液），测定出OD₅₉₅。

表2.标准曲线设计及所测吸光度值

通过利用Excel绘制标准曲线：如图。

蛋白质含量计算：

可溶性蛋白质含量（mg/g）=(C×VT)×（W×VS×1000）

C是利用标准曲线所的的蛋白质的含量（µg）；VT 是提取液总体积（稀释后的体积ml，100μl）；VS是在实验时所用提取液体积（ml,20µl）; W为小麦叶片样品鲜重（g）。

2.5.6植物细胞质膜透性的测定（电导仪法）

电导率的测定使用的仪器是上海雷磁新泾仪器有限公司生产的DDS-11A型电导率仪。先准备好0.2g不萎蔫的新鲜小麦幼苗叶片，并按顺序先在自来水下冲洗叶片，之后用去离子水冲洗并且用吸水纸擦干。然后将叶片剪碎并置于大试管中，加入10ml的去离子水，将试管置于室温下3h，时间到后测定溶液电导率R1。最后将试管置于100℃水浴锅中进行水浴，耗时20min以保证叶片组织被杀死，在用冷水将试管冷却至室温后测定溶液电导率R2。用公式计算质膜相对透性（用相对电导率表示）：

相对电导率（%）=R1/R2×100%

2.6 数据分析

以Excel2010和SPSS 16.0软件为处理工具，对实验所测得数据进行统计分析和差异性分析。

3 结果与分析

3.1精胺对盐胁迫下小麦幼苗株高的影响

分别在盐胁迫处理0d、3d、、6d、9d、12d后采样，用直尺对株高进行测量取平均值，并在培养12d后拍照记录，结果见图1、图2。

CK NaCl 0.05g/L Spm 0.075g/L Spm 0.1g/L Spm

图1 不同浓度精胺对盐胁迫下小麦幼苗生长的影响

图2不同浓度精胺对盐胁迫下小麦幼苗株高的影响

由图1可以看出，在盐处理12天后，加入NaCl的小麦幼苗已经出现了十分明显的盐害反应，绿色叶片数量减少，出现枯萎变黄的现象。在加入精胺处理的植株中，叶片枯萎的情况有所缓和，其中加入0.1g/L spm 的植株最为明显。

从图2可以看出，在用浓度为100mmol的NaCl进行盐处理12d后，小麦幼苗叶片中的株高增长量与未处理的对照相比提高了51％，达到显著水平（P＜0.01）；在加入0.05g/L spm缓解后，其株高增长量与单独的盐处理相比提高了31％，达到显著水平（P＜0.05）；在加入0.075g/L spm缓解后，其株高增长量与单独盐处理相比提高了38％，达到显著水平（P＜0.05）；在加入0.1g/L spm缓解后，其株高增长量与单独盐处理相比提高了41％，达到显著水平（P＜0.05）；由此可以说明，盐胁迫对于小麦幼苗的生长存在着抑制作用，而精胺（spm）在一定程度上可以缓解盐胁迫对于小麦幼苗的伤害。0.1g/L精胺的缓解效果最好，这与王强^[12]等人的研究结果相一致。

3.2精胺（spm）对盐胁迫下小麦幼苗叶片POD活性的影响

分别在实验处理的0d、3d、、6d、9d、12d时，采用愈创木酚法对叶片的POD进行测定，结果如图3。

图3 不同浓度精胺缓解盐胁迫下小麦的POD活性变化

由图3可以看出，在用浓度为100mmol的NaCl进行盐处理12d后，小麦幼苗叶片中的POD活性与未处理的对照相比提高了41.9％，达到显著水平（P＜0.05）；在加入0.05g/Lspm缓解后，其POD活性与单独盐处理相比提高了27.9％，达到显著水平（P＜0.05）；加入了0.075g/Lspm缓解后，其POD活性与单独的盐处理相比提高了39.5％，达到显著水平（P＜0.05）；加入了0.1g/Lspm缓解后，其POD活性与单独的盐处理相比提高了46.1％，达到显著水平（P＜0.05）。

由此表明，盐处理能使小麦幼苗的POD活性变大，且在一定时间内spm能使盐胁迫下小麦叶片的POD活性进一步变大，从而缓解盐胁迫对小麦幼苗的伤害。

3.3精胺（spm）对盐胁迫下小麦幼苗叶片SOD活性的影响

分别在实验处理的0d、3d、、6d、9d、12d时，采用氮蓝四唑比色法对小麦叶片的SOD活性进行测定,结果如图4。

图4不同浓度精胺对盐胁迫下小麦幼苗叶片SOD活性的影响

在用浓度为100mmol的NaCl进行盐处理12d后，小麦幼苗叶片中的SOD活性与未处理的对照相比提高了20.6％，达到显著水平（P＜0.05）；在加入0.05g/Lspm缓解后，其SOD活性与单独的盐处理相比提高了7.5％，未达到显著水平（P＞0.05）；在加入0.075g/Lspm缓解后，其SOD活性与单独的盐处理相比提高了11.5％，达到显著水平（P＜0.05）；在加入0.1g/Lspm缓解后,其SOD活性与单独的盐处理相比提高了15.7％，达到显著水平（P＜0.05）。在加入spm缓解后，小麦叶片的SOD活性在第6天出现最大值，这与段九菊等人的研究结果一致^[13]。

由此说明，单独的盐处理能使小麦幼苗的SOD活性变大，且spm能使盐胁迫下小麦叶片的SOD活性进一步变大，从而缓解盐胁迫对小麦幼苗的伤害。

3.4精胺（spm）对盐胁迫下小麦幼苗叶片细胞质膜透性的影响

在实验处理的0d、3d、、6d、9d、12d 后，用电导率仪对小麦叶片的相对电导率进行测定，如图5。

图5 不同浓度精胺对盐胁迫下小麦幼苗叶片细胞质膜透性的影响

根据图5可知，在用浓度为100mmol的NaCl进行盐处理12d后，小麦幼苗叶片中的相对电导率与未处理的对照相比提高了70％，叶片细胞质膜透性显著增加（P＜0.05）；加入0.05g/Lspm缓解处理后，小麦幼苗叶片的相对电导率与单独盐处理相比降低了8.6％，叶片细胞质膜透性显著降低（P＜0.05）；加入0.075g/Lspm缓解后，小麦幼苗叶片的相对电导率与单独盐处理相比降低了13.8％，叶片细胞质膜透性显著降低（P＜0.05）；加入0.1g/Lspm缓解后，小麦幼苗叶片的相对电导率与单独盐处理相比降低了19％，叶片细胞质膜透性显著降低（P＜0.05）。

由此表明，盐胁迫下的小麦幼苗，膜的功能受到损伤而透性增大，小麦幼苗的相对电导率升高。在加入精胺缓解后，在盐胁迫下小麦幼苗叶片的相对电导率下降，说明加入精胺可以降低盐胁迫对小麦叶片膜透性的影响，使用精胺浓度为0.1g/L时小麦叶片质膜透性最低。

3.5精胺对盐胁迫下小麦幼苗叶片超氧阴离子自由基的影响

在实验处理的0d、3d、、6d、9d、12d 后，采用羟胺氧化法对小麦叶片的超氧阴离子自由基（O₂•^-）含量进行测定，如图6。

图6 不同浓度精胺对盐胁迫下小麦幼苗叶片超氧阴离子自由基的影响

根据图6所示，在用浓度为100mmol的NaCl进行盐处理12d后，小麦幼苗叶片中的超氧阴离子自由基含量与未处理的对照相比提高了46.4％，O₂•^-含量显著增加（P＜0.05）；加入0.05g/Lspm缓解处理后，小麦幼苗叶片的O₂•^-含量与单独盐处理相比降低了12.1％，达到显著水平（P＜0.05）；加入0.075g/Lspm缓解后，小麦幼苗叶片的O₂•^-含量与单独盐处理相比降低了21.9％，达到显著水平（P＜0.05）；加入0.1g/Lspm缓解后，小麦幼苗叶片的O₂•^-含量与单独盐处理相比降低了46.3％，达到显著水平（P＜0.05）。

由此可以看出，小麦叶片的超氧阴离子自由基（O₂•^-）含量受到盐胁迫的影响而上升，不同浓度的精胺(spm)在一定程度上可以缓解盐胁迫的影响。在本实验中，使用精胺浓度为0.1g/L时小麦幼苗叶片的O₂•^-含量最低。

3.6精胺（spm）对盐胁迫下小麦幼苗叶片可溶性蛋白含量的影响

在盐胁迫处理12d后，采用考马斯亮蓝法测定小麦幼苗叶片的可溶性蛋白质，结果如图7。

图7 不同浓度精胺对盐胁迫下小麦幼苗叶片可溶性蛋白含量的影响

根据图7可以看出，在盐胁迫下的小麦叶片与正常培养下的小麦叶片相比，蛋白质含量减少了37％，达到显著水平（P＜0.05）。在用浓度为0.05g/L spm进行缓解处理后的小麦幼苗叶片与盐胁迫下培养的小麦幼苗叶片相比，蛋白质含量增加了17％，达到显著水平（P＜0.05）；在用浓度为0.075g/L spm进行缓解处理后的小麦叶片与盐胁迫下培养的小麦幼苗叶片相比，蛋白质含量增加了26％，达到显著水平（P＜0.05）；在浓度为0.1g/L spm下的小麦叶片和在盐胁迫下培养的小麦叶片相比，蛋白质含量增加了38％，达到显著水平（P＜0.05）；

由此可以看出，小麦叶片的可溶性蛋白质含量受盐胁迫影响而有所下降，不同浓度的精胺（spm）在一定程度上可以缓解盐胁迫对小麦叶片中蛋白质含量的影响。精胺浓度越高，缓解效果越好。

结论

本实验研究了精胺（spm）缓解盐胁迫对小麦幼苗的影响，且设置了三个的精胺浓度梯度。通过本实验，得到以下结论：盐胁迫对小麦幼苗的生长发育有抑制作用，与未进行盐胁迫处理的对照相比叶片明显发黄、株高受到抑制，SOD、POD活性升高，超氧阴离子自由基含量升高，可溶性蛋白质含量减少，小麦叶片的相对电导率升高。这与袁颖辉^[8]等人研究盐胁迫对小麦的影响得出的结论相似。

此外，精胺对盐胁迫下的小麦幼苗有缓解作用，在精胺处理下的小麦幼苗植株叶片枯黄减少，植株生长水平有所提高。精胺还能增强盐胁迫下小麦叶片的SOD、POD活性，增强清除超氧阴离子自由基的能力，降低超氧阴离子自由基的含量，还能增加可溶性蛋白含量和降低叶片细胞质膜透性。使用0.1g/L的精胺对盐胁迫下小麦幼苗的缓解效果最好。

参考文献

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