施用微生物菌剂对于黄瓜根围微生态的影响

 2023-07-12 09:07

论文总字数：8516字

摘 要

植物根围微生物号称植物的“第二基因组”，其与植物的健康息息相关。本研究通过PCR-DGGE分析了施用微生物菌剂后不同时间对黄瓜根围微生物多样性的影响。结果表明：使用微生物菌剂后黄瓜根围细菌多样性显著提高，并且随时间延长处理组和对照组之间差异性愈加明显。在施用微生物菌剂后，黄瓜根围假单胞属细菌逐渐增加并且成为优势种群。

关键词： 黄瓜，根围，微生物菌剂，微生物多样性

Abstract: Plant rhizosphere microorganisms known as "second genome", which is closely related to plant health. The study, which is based on PCR-DGGE, analyzed the effects of different times of cucumber rhizosphere microbial diversity after the application of microbial agents. The results showed that: After using microbial agents in cucumber rhizosphere, the bacterial diversity increased observably and the differences between the treatment and control groups became more apparent over time. Moreover, the cucumber rhizosphere Pseudomonas species gradually increased and became dominant populations.

Keywords: mushroom; residue returning; rhizosphere; Microbial diversity

目录

1 前言 3

2 材料与方法 4

2.1 实验设计 4

2.2 土壤采集方式 4

2.3 微生物多样性检测方法 4

2.3.1 土壤DNA的提取 4

2.3.2 细菌16S rDNA片段的PCR扩增 4

2.3.3 PCR产物的变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析 5

2.3.4 DGGE图谱中优势条带的回收与测序 5

2.3.5 数据分析 6

3 结果与分析 6

3.1 土壤样品DNA提取结果 6

3.2 细菌16S rDNA的PCR扩增 7

3.3 PCR产物的变性梯度凝胶电泳（DGGE） 8

3.4 主成分分析 9

3.5 DGGE测序条带的系统发育树构建 10

结论 12

参考文献 13

1 前言

设施农业是综合应用工程装备技术、生物技术和环境技术，创造动植物生长发育的适宜环境，实现动植物生产的现代农业生产方式[1]。截至2010年底，我国设施蔬菜年种植面积估计约达466.7 万hm2，分别占我国设施栽培的95 % 和世界设施园艺80 % 的面积，成为世界上设施面积最大的国家[1]。其中黄瓜（Cucumis sativus L.）是设施蔬菜生产中主要栽培作物，其栽培面积约占设施栽培面积的60%[2]。设施栽培中，蔬菜病虫害的病原菌常潜伏于土壤中，如黄瓜、茄子的枯萎病，疫病等其病菌孢子常在土壤内越冬，来年继续为害。另外大棚内温度高湿度大，在这样小气候条件下，易于蔬菜病虫害的发生和相互传播，对蔬菜为害较大，容易形成恶性循环。随着连作年限的增加，有害真菌的种类和数量增加，土壤中病原菌的拮抗菌减少，进一步加重了土传病害。

其中黄瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum. sp. cucumebrium Owen）所引起的重要黄瓜病害，常年发病率10-30%，重病年份可达80-90%。由于保护地的特殊环境条件和长期连作，土壤中的病原菌量积累越来越多，致使黄瓜枯萎病的发生逐年加重。目前主要采取嫁接，生物防治，化学农药以及轮作的方式进行防治。其中，生物防治由于其自身无毒无害，环境友好等特点开始受到越来越多的重视。而生物防治防治效果是否稳定的关键就在于所施用的微生物菌剂对于原有土著种群的影响，能否建立起有利于寄主植物健康的根围微生态。

根围微生态重置是指通过轮作、微生态制剂、生物菌肥等方式主动调节植物根围微生物群落结构来构建一个有利于植物健康生长的微生态环境从而保证寄主的健康生长[3]。Zhu 等发现，健康大豆植株、被线虫侵染的大豆植株以及被线虫侵染植株同时接种Purpureocillium lilacinus YES- 2 菌株后，三者的根围细菌多样性存在明显差别[4]。因为在植物根围这个微环境中，土传病原菌能否形成有效侵染种群密度主要取决于它在和土著种群的竞争中能否占得优势，这在以往关于抑制性土壤的研究中广泛报道[5~7] 。

本研究以实验室现有微生物菌剂作为研究对象，检测其在防治黄瓜枯萎病过程中对于黄瓜根围原有微生态的影响，从而为该菌剂的科学使用提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 实验设计

本研究以设施栽培黄瓜作为研究对象，在黄瓜移栽时利用本实验室现有微生物菌剂“宁盾”进行灌根处理，并在移栽后1、2、3个月时分别采集黄瓜根围土壤进行检测。以未使用微生物菌剂的黄瓜作为对照组，处理组和对照组实验小区随机分布，每个处理3次重复，每个重复小区面积3*2m2。处理组分别标记为T0-1, T0-2, T0-3, T1-1, T1-2, T1-3, T2-1, T2-2, T2-3; 对照组分别标记为C0-1, C0-2, C0-3, C1-1, C1-2, C1-3, C2-1, C2-2, C2-3。

2.2 土壤采集方式

整个土壤采集过程采用三点取样法，每个小区等距离选取黄瓜植株三株，首先将黄瓜植株拔出，轻轻抖动以去除粘附的大量土壤，再利用毛刷轻轻刷下紧贴在黄瓜根部的根围土，三株黄瓜样品混合在一起，装入塑封袋放在冰盒中带回实验室，样品前期处理后研磨过2mm筛。进行土壤总DNA 的提取、进行PCR-DGGE分析，部分置于阴凉通风处自然干燥至恒重，用作土壤理化性质及酶活性检测。剩余的则置于-20℃冰箱保存备用。

2.3 微生物多样性检测方法

2.3.1 土壤DNA的提取

本实验是利用FastDNA SPIN Kit for Soil（MPbio，USA）试剂盒进行总DNA的提取用于变性梯度凝胶电泳分析（DGGE）。提取方法参照试剂盒实验说明。

2.3.2 细菌16S rDNA片段的PCR扩增

以样品基因组DNA为模板，采用细菌通用引物GC-338F和518R扩增样品16S rDNA高变区序列。

表1：本实验引物信息

Primer

Sequence

338F

CCT ACG GGA GGC AGC AG

518R

ATT ACC GCG GCT GCT GG

GC338F

CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGGCGGGGCGGGGGCGCGGGGGG

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