论文总字数：16265字

目 录

1 引言 5

2 材料和方法 6

2.1 开顶式气室 6

2.2 O₃增加的试验设计 6

2.3 根际取样 6

2.4 微生物数量测定 6

1.4.1细菌数量的测定 6

2.4.2放线菌数量的测定 6

2.4.3真菌数量的测定 7

2.5 磷脂脂肪酸（PLFA）的分离和分析 7

2.6 微生物群落PLFA标记分析与含量计算 7

2.7 数据处理 7

3 结果与分析 8

3.1 O₃浓度增加，对小麦根际土壤细菌数量的影响 8

3.2 O₃浓度增加，对小麦根际土壤真菌数量的影响 8

3.3 O₃浓度增加，对小麦根际土壤细放线菌数量的影响 9

3.4 不同O₃处理小麦根际土壤微生物群落磷脂脂肪酸生物标记分析 10

4 讨论与结论 12

4.1 O₃浓度增加对细菌、真菌、放线菌的影响效应 12

4.2 不同O₃浓度处理下小麦根际土壤微生物的PLFA分析 12

4.3结论 13

参考文献 13

致谢 15

地表O₃浓度增加对小麦根际土壤微生物群落结构的影响

马兆鹏

，China

Abstract: In order to study the effect of the increase of surface ozone concentration on soil microbial community structure, I use the open top chamber (OTC) and the field experiment planting wheat. The number of bacteria, fungi and actinomycetes in wheat rhizosphere soil was determined with the dilution plate smear culture count method. Meanwhile, the microbial biomass of different taxa was analyzed, using the extraction of fatty acid biomarkers in soil by phospholipid fatty acid method. The results showed that the increase of the amount of bacteria in the soil increased with the increase of O₃ concentration at 100nL / L and 150nL / L, and the increase of the number of bacteria in the soil had the effect of first and second inhibition. At the heading stage of wheat, the number of bacteria reached the highest Fungi and actinomycetes in the soil were continuously increased and decreased. The increase in the concentration of ozone on the number of bacteria and actinomycetes inhibit the number of fungi to promote the role.

Keywords: Ozone concentration; Soil rhizosphere; Microbial community

1 引言

臭氧在大气中的分布状况是平流层较多，对流层较少。平流层中的臭氧可以阻挡部分紫外线的照射，有益于生物体的生长。也有少部分的臭氧分子存在于近地面。低浓度臭氧可以运用来消毒^[1]，应用臭氧消毒饮用水和处理污水的做法十分普遍^[2]，在农业领域也用来防治病虫、解除农药残留^[3]。

但一些观测研究结果表明，近些年来，平流层的臭氧量开始下降，同时对流层的臭氧浓度则以0.5%～2.5%的速度在增长^[4][5]。臭氧浓度增加对人体健康有强烈影响，臭氧是一种强氧化剂，能强烈刺激呼吸道，损害人体神经、支气管、皮肤和肺部等组织功能；严重的是淋巴细胞会被臭氧损害从而造成染色体病变，最终导致人衰老加快，使人更容易患上心血管等疾病 ^[6]。

臭氧浓度增加带来了一系列生态问题，全球的气候会被臭氧浓度变化扰乱造成大气温度上升，同时引发二氧化碳量的增加，温室效应进一步加剧^[7]。此外，汽车尾气和工业废气排放在城市中含有大量的烯烃,碳氢化合物和二氧化氮(NO₂),这些被释放到大气中被紫外线强烈照射后，能量被积累形成了大量的O₃，造成光化学烟雾现象，根据目前的一些资料来看，近地面臭氧成为了我国许多地区空气质量的主要污染物^[5]。

近地臭氧对植物生长也存在威胁，主要表现为植物体中的叶绿素和类红叶素等在臭氧作用下含量降低,从而影响光合作用。学者研究表明，植物体结构和生理功能方面都受到臭氧浓度增加的影响，由此扰乱生态系统层次 ^[8]。具体表现包括：植株矮化；叶片数下降；根茎生长受限制；作物产量下降。农作物的经济效益也会下降，比如农作物外观改变，农产品的品质和口感降低。臭氧污染对植物的伤害也会进一步影响土壤，造成土壤肥力降低，植物在大气中受臭氧污染时，同化的二氧化碳量减少，土壤微生物从植物中得到的碳量下降，微生物繁殖受到抑制。土壤的富集能力和碳加工能力由于土壤微生物活性降低而下降。现有研究表明臭氧对植物地下部分的影响的时间点比对地上部分的影响要早^[18]，生物量降低也较为明显，但存在地下臭氧积累的影响,生态系统地下部分直接影响植物的养分吸收、水的利用和能量物质流通。学者们研究臭氧对植物的影响,包括根系生物量和臭氧对植物根系分泌物和土壤微生物的影响。地表O₃浓度持续增加,会使植株叶绿素含量、光合速率降低，提前老化，生育期变短^[9][10]；许多学者研究臭氧对植物的作用,同时考虑到臭氧对根生物量的影响^[11][12]，而臭氧对植物根系分泌物及土壤微生物群落结构的影响较少。主要受研究手段的限制，磷酸脂肪酸法，利用微生物体内磷酸脂肪酸的种类，分析微生物的群落组成，为微生物群落结构的研究提供有利手段。为地表O₃浓度增加产生的土壤微生态效应提供参考。

2 材料和方法

2.1 开顶式气室

气室主要由不锈钢制成的框架总成,上部和下部为正八棱柱，框架外部包裹聚乙烯塑料膜。气室包括了通风、O₃发生、O₃浓度控制和监测各个系统。O₃发生器为WJ-H-Y 5型O3发生器（产地为南京）, 产量为每小时5g,可安装电子阀门实现对臭氧浓度的调节控制；然后借助sf2-2型轴流式风机（产地为沈阳）排入开顶式气室；空气中的氧气电解产生臭氧,在风扇的作用下空气和由此产生的O3混合气体分配系统吹到作物冠层;采用S200 O₃检测仪（新西兰公司生产）对气室内的O₃浓度进行实时监测 ^[13-14]。

2.2 O₃增加的试验设计

利用开顶式气室(OTC)内O₃浓度增加对冬小麦的影响，设置9个开顶式气室分属3个处理组，每处理设置3个重复。小麦返青期前开始通O₃曝气处理，灌浆期停止曝气，曝气时段为每天早上8点到下午4点,一共8h。实验设3个处理:(1)对照,通过未经处理的空气;(2)CF100处理;气室O₃浓度100nl/L;(3)CF150处理;气室的臭氧浓度150nl/L。同时,开顶式气室设置在一个自动气象监测系统，掌握气室内空气温度、湿度和太阳辐射的变化情况 ^[15][16]。

2.3 根际取样

根际土壤取样方法可将小麦连根拔起,然后将根部周围松散的土壤抖落，留下的土壤即根际土^[16]。之后采用五点法，以种植小麦为中心，划定一个半径约 20-30 mm的取土范围，取土时深度为 0至25 cm，不同的土壤样品都能通过这样的方法取样，在每个点取重复6次，四分法搅拌混匀，再装入无菌袋中，放进低温的盒内带回进行进一步处理，土壤中的残留杂质包括许多断根，小石子等，为确保实验顺利进行要挑选扔掉这些杂质，最后将土壤样品保存在-80℃的超低温冰箱中^[17]。

2.4 微生物数量测定

1.4.1细菌数量的测定

培育细菌培养基中的每种物质为微生物提供无机盐和不同的成分，牛肉膏用来提供维生素、磷酸盐和碳源，蛋白胨为微生物提供维生素和氮源，氯化钠用于提供无机盐放线菌。琼脂制备固体培养基的混凝剂。在正常浓度,当温度达到96摄氏度时,琼脂就会溶解。实际应用时将用石棉垫或沸水浴煮沸，以防止琼脂在高温下烧焦。当温度低于40摄氏度时，琼脂凝固，微生物难以分解利用。在固体培养基中，琼脂的含量会随着琼脂的质量和所处环境气温的变化而变化。为了促进细菌生长繁殖,pH值要求中性或微碱性，可以用稀酸和稀碱调节。

2.4.2放线菌数量的测定

培养放线菌培养基主要特点是含有许多已知化学成分的无机盐，无机盐在培养基中会相互作用产生沉淀。制备配方包括了：可溶性淀粉，琼脂、KNO₃、MgSO₄·7H2O、NaCl、K₂HPO₄、FeSO₄·7H₂O 0.01g，pH值要求为7.5左右。配制过程是先用水把淀粉均匀调糊，再倒入少量的沸水中高温加热，通过搅拌来溶化培养基中各个成分，搅拌均匀溶化后，加水到100ml，用稀酸稀碱调节pH，在121℃高温下灭菌20min。加入10%苯酚到 100ml培养基中混合混匀，培养基倒入平皿内，每个大约15ml量。

2.4.3真菌数量的测定

真菌采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基） ，配置过程先将马铃薯洗干净削去皮,称量小块马铃薯放入沸水中煮至马铃薯表面能被玻璃棒戳破即可，用纱布过滤后加热，依照实验需求加入琼脂，继续加热，搅拌并混合均匀，待琼脂完全溶解，加葡萄糖搅拌均匀，冷却后加水至1000ml，分装在锥形瓶中保存，在121℃高温下灭菌20min。最后将取出的锥形瓶摇匀，冷却后贮存。

2.5 磷脂脂肪酸（PLFA）的分离和分析

磷脂脂肪酸（PLFA）常用于研究各种群落中的微生物多样性^[17]，指示数量上较多的土壤微生物群落，包括了一些难以在培养基环境中培养的微生物。一切活细胞的细胞膜中都含有磷脂，磷脂的组分中包括了PLFA，PLFA具有显著的生物特异性和结构多样性，所以，细菌、真菌、放线菌这些土壤微生物会和PLFA谱中存在的特征脂肪酸显示特异，即表明PLFA是有效的生物标记物，土壤微生物的群落结构更加易于观察。提取PLFA方法多种多样，可采用简单提取法、在简单提取方法基础上改进的扩展提取以及用微生物鉴定系统(MIDI)提取等^[17]。本实验采用MIDI公司(www.midi-inc.com)开发的Sherlock系统， PLFAs组成和含量快速测定，短时间内校准数据消除误差，可用于检测土壤微生物群落数量。微生物鉴定系统的操作步骤包括了用皂化/裂解液在脂类中裂解出脂肪酸,在80℃温度下加入甲醇盐酸溶液,使脂肪酸甲基化形成全自动酶免分析系统FAME谱图,提取FAME谱图,进行气相色谱（GC）分析等。

2.6 微生物群落PLFA标记分析与含量计算

不同的PLFA标记特定的微生物，12: 0w、14:0w、15:0w、16:0w与20:0w 标记细菌^[26][27][28]，il5:0w、al6:0、il7:0与il8:0标记革兰氏阳性菌^[29][30]，il4:0w 标记好氧细菌^[31]，16:lw9c标记革兰氏阴性菌^[29][31]，10Mel6:0w 标记硫酸盐还原细菌^[27]，10Mell7 :0w与10Mel8 :0w 标记放线菌^[31][32]，18 :0w标记嗜热解氢杆菌^[27]，18:lw9c与18:2w9标记真菌^[33]，18 :lw7c 标记假单胞杆菌^[30]，_cy19:0_w8_c标记伯克霍尔德菌，20：4w6，9，12，15c标记原生动物^[19]。

PLFAs含量的计算参照参考文献^[20]。

2.7 数据处理

主要通过SPSS和EXCEL软件对数据进行统计处理和分析，并绘制图表，观测数据经过软件分析后，求出方差、标准差等,对不同处理下的数据进行差异性分析，用LSD法检验处理组之间差异的显著性。

3 结果与分析

3.1 O₃浓度增加，对小麦根际土壤细菌数量的影响

由图1可以看出,O₃浓度增加对小麦根际土壤中细菌的增长具有先促进后抑制的作用。O3通气处理的前期（拔节期-孕穗期）,CK处理与CF100处理之间的差异并不显著(p＞0.05)；到了中期(抽穗期), CF100处理与CF150处理之间的差异不显著(p＞0.05)；最后两期（灌浆期-成熟期）各处理之间的差异性都较明显(p＜0.05)。在观察结束时,该CF150和CF100细菌数量分别增加了25.4%和83.3%,与对照相比,在整个生长季CK的平均增长率为2.42%，CF100处理和CF150处理的总平均降幅分别为2.88%和11.74%,三个处理的最大增幅都出现在抽穗期，最大降幅都出现在了成熟期。结果表明，臭氧剂量的增加会降低小麦根际土壤中的细菌量，根据观测的数据，在CK处理下的根际土壤细菌含量始终与CF150处理含量存在显著性差异。从小麦的生长周期看，细菌的含量在抽穗期之前保持增长趋势并在抽穗期达到顶峰，之后开始下降，随着小麦逐渐成熟，在臭氧浓度的影响下成熟期的细菌含量下降最为明显。

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