论文总字数：42806字

摘 要

论文以高氨氮抗生素废水好氧生物处理系统为研究对象，深入系统研究了MBR反应器对青霉素/氨氮废水的处理效能，并应用高通量测序等分子生物学手段分析了反应器中微生物菌群结构及硝化功能菌群的演替规律，为高氨氮抗生素废水高效处理提供理论依据和技术支撑，主要结论如下：

(1)处理进水氨氮负荷在250 mg/L及以下的青霉素废水，MBR反应器可以迅速达到运行稳定，处理进水氨氮负荷在500 mg/L的青霉素废水，MBR处理效果下降，但是经过一段时间波动后也可以达到运行稳定。

(2)氨氮负荷的提高能够改变MBR反应器的菌群结构。其中在门水平，变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Acidobacteria）始终在MBR反应器菌群中占有绝对优势。变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）的丰度随运行时间有上升趋势。在属水平，Geminicoccus属、Meganama属和Marinicella属三种菌属的丰度随反应器运行时间呈上升趋势，原因推测是它们对高盐环境或极端恶劣环境有良好的耐受性。在MBR反应器菌群中，硝化螺旋杆菌属（Nitrospira）是主要的硝化菌属，它的丰度变化与出水氮元素的形态变化有良好的契合关系，而且与其生长呈正相关关系的主要是具有反硝化功能的菌属。

关键词：MBR；青霉素/氨氮废水；高通量测序；菌群结构;硝化螺旋菌属

The Influence of Ammonia Loading to Operational Stability of MBR Reactor Treating Penicillin Wastewater and the Microbial Community Structure

Abstract： With high concentrations of pollutants and a lot of refractory material, the composition of Antibiotic wastewater is complex and the microbial toxicity is strong. Many kinds of antibiotic wastewater have a characteristic of high ammonia nitrogen. Direct emissions of untreated antibiotic wastewater and treated antibiotic wastewater below standard will affect receiving water body constitution, destroy the ecological balance. With improvements of the public's awareness of environmental protection and the improvement of national wastewater discharge standard, efficient processing of antibiotic wastewater with high ammonia nitrogen is one of the environmental engineering problems that need solving. Membrane Bio-Reactor maintains a large amount of biomass by withholding the sludge, achieving high organic pollution degradation and high ammonia nitrogen removal efficiency. So it has been the focus of the research in wastewater treatment engineering.

Paper makes antibiotic wastewater with high ammonia nitrogen in aerobic biological treatment system as the research object. On the basis of a large number of investigation into the microbiological characteristics of wastewater aerobic treatment process which reaches stable operation, treatment efficiency of MBR reactor system treating penicillin/ammonia nitrogen wastewater is studied deeply. And molecular biology means such as high-throughput sequencing are also applied to analyze the succession law of microbial communities and nitrite-oxidizing bacteria in the MBR reactor, providing theoretical basis and technical support for effective treatment of antibiotics wastewater with high ammonia nitrogen. The main results of the paper are as follows:

1. For processing penicillin wastewater with ammonia nitrogen concentration below 250 mg/L, MBR reactor can reach stable operation quickly. And for processing penicillin wastewater with ammonia nitrogen concentration of 500 mg/L, The effect is not as good as before, but after a period of fluctuations, MBR can also achieve stable operation.
2. The improvement of ammonia nitrogen load can change the structure of bacterial flora in MBR reactor. For phylum level, Proteobacteria, Bacteroidetes, Acidobacteria always holds an absolute advantage in the bacterial flora. And the abundance of Proteobacteria and Firmicutes has a rising trend with operation time. For genera level, the abundance of Geminicoccus, Meganama, Marinicella has a rising trend with operation time. And the estimated reason is that they are well tolerable to high salt environment or extreme environment. Genera Nitrospira is the main kind of nitrite-oxidizing bacteria in the bacterial flora. The changes of its abundance has a good interactive relationship with water quality index. And its growth was positively related to genus which has the function of denitrifying.

Key words: MBR；penicillin/ ammonia nitrogen wastewater；high-throughput sequencing；bacterial flora；Genera Nitrospira

氨氮负荷对青霉素废水处理MBR反应器运行稳定和菌群结构影响

第一章 绪论

1.1 引言

我国淡水资源总量仅占全球淡水资源总量的6%，人均水资源占有量仅有世界平均水平的四分之一，水资源相对短缺。据中国水资源公报(2014)和全国环境统计公报(2014)统计，2014年全国工业用水量约为1353亿吨，占总用水量的22.2%，而2014年全国工业废水排放总量约为205.3亿吨，占总排放量的28.6%，工业生产对水资源的污染十分严重。制药工业是我国工业的重要组成部分之一，国内制药企业约有5000家。制药工业低门槛高回报的特点，导致制药企业分布广泛，且制药工业对水资源要求高，选址多在水源地旁。因此，制药废水成为我国各水系主要的污染源之一。根据中国环保部、质监局的排放标准(GB 21903-2008至GB 21908-2008)，制药废水可分为发酵类、化学合成类、混装制剂类，生物工程类，提取类，中药类等六大类，其中发酵(主要为抗生素)类废水是制药废水中较难处理的废水之一。

1.2 抗生素废水来源、特征及危害

1.2.1 废水来源

抗生素生产方法主要分为生物发酵法、全化学合成法和半化学合成法等。目前我国主要的生产方式为生物发酵法。生物发酵法主要分为发酵、提取、精制等三个阶段：其中发酵阶段产生的废水BOD₅可达4000-13000mg/L，若发酵过程失败BOD₅可达20000-30000mg/L；提取阶段主要是酸、碱废水和有机溶剂污染；精制阶段主要是脱色提纯过程产生的污染；除了生产过程，设备清洗及冷却过程也会造成水污染^{[1, 2]}。

1.2.2 废水特征

抗生素生产废水组成成分复杂，污染物浓度高，含有大量难降解物质，且对微生物毒性抑制性强^[3]。其具体特征如下：

(1) COD较高

目前我国抗生素生产由于技术限制，造成生产效率较低，生产过程中会残留大量有机物，包括剩余培养基、发酵滤液、提取过程使用的有机溶剂以及回收后排出的蒸馏釜残液等。这些残留的有机物造成抗生素生产废水中COD可达60000mg/L以上^[4]。

(2)氨氮负荷较高

氮元素是微生物生长必须的营养物质，在抗生素生产过程中往往会添加过量的氮源，以促进微生物生长，但较低的利用率导致废水中的氨氮负荷可达到500mg/L以上^[5]。

(3)水质波动较大

制药企业往往会根据市场变化而选择生产高价值的药物，造成生产量及产品很难固定，导致抗生素生产废水水质波动较大。

(4)冲击负荷较大

抗生素的生产很少连续进行，间歇式排水造成大量废水集中排放，导致冲击负荷较大。

(5)有毒有害物质较多

抗生素生产废水中的有毒有害物质主要分为两部分，一部分是提取及纯化过程中所用的酸、碱、有机溶剂，另一部分是发酵产生的副产物及未提取出的残余抗生素。这些物质会对微生物的生长繁殖产生抑制作用，使抗生素生产废水生物处理效果下降。

1.2.3 废水危害

抗生素废水水质复杂多变，目前的废水处理工艺存在着成本偏高、针对性差等诸多不足之处。此外，一些小型制药企业时常存在处理不达标的问题，这部分废水由于其高COD、高氨氮、高生物毒性的特征会影响受纳水体水质，破坏生态平衡^[6]。

1.3 抗生素生产废水处理现状

目前针对抗生素废水处理的方法有很多，主要可以分为物化处理方法和生物处理方法两大类^[2]。

1.3.1物化处理法

物化处理法虽然具有见效快、操作方便等优点，但也存在运行费用高、二次污染严重等问题，导致其一般被用作抗生素废水处理的辅助手段。物化处理法工艺众多，目前研究较多的方法包括混凝法，纳滤膜分离法，高级氧化法等。

（1）混凝法

混凝法主要是使水中的悬浮固体及胶体杂质脱稳而相互结合，通过自然沉降的方式去除，同时降低废水的色度与浊度，提高废水的可生物降解性。但由于处理过程中会产生大量的化学污泥，造成二次污染，故主要被用于抗生素废水的预处理。孙贤风等^[7]研究了混凝法对土霉素废水的处理效果，结果发现混凝法在去除COD的同时，还能将废水的B/C提高一倍。饶义平等^[8]研究了复合絮凝剂对抗生素废水抑菌能力的削弱效果，结果发现含Ca² 的复合絮凝剂能明显降低药物效价强度。

（2）纳滤膜分离技术

纳滤膜分离技术在抗生素废水处理中已经开始得到应用，其优点在于产生环境效益的同时还可以从废水中回收有用物质，产生经济效益。纳滤膜分离技术的工艺特点决定其主要会被用于废水的深度处理及产物回收过程，但由于成本过高、膜寿命较短等缺点，在实际工程中还未广泛使用。纪树兰等^[9]研究了纳滤膜分离技术对洁霉素废水的处理效果，结果发现纳滤膜分离技术对洁霉素的回收率可达95%。Zhang等^[10]研究了复合纳滤膜对抗生素的浓缩作用，结果发现哌嗪和均苯三甲酰氯界面聚合法制备的纳滤膜可截留99%的抗生素。

（3）高级氧化法

高级氧化法是通过产生羟基自由基（•OH)，使水体中的大分子有机物直接矿化或氧化成生物易降解的小分子物质。但由于高级氧化法运行成本高，所以基本不用于直接矿化，而多用于预处理阶段，其可有效提高废水的可生化性，并降低废水毒性。高级氧化法处理抗生素废水在国内外均有较多的研究，翁宏定^[11]研究了Fenton氧化法对土霉素废水的处理效果，结果表明Fenton氧化法可将废水的B/C由0.19提高至0.47。Arslan-Alaton等^[12]研究了臭氧氧化、Fenton氧化及类Fenton氧化对青霉素废水的处理效果，结果表明这些方法中，光-类Fenton(Fe³ )法在对青霉素废水的COD去除效果最好，臭氧氧化法对提高生物可用性的能力最强。此外该研究还发现，两种高级氧化法均能在40分钟内使青霉素失去活性。

1.3.2生物处理法

生物处理法由于运行费用低、不产生二次污染等优点，是处理抗生素废水的主要手段，生物处理法大致可分为厌氧生物处理法和好氧生物处理法两大类。

（1）厌氧生物处理法

厌氧生物处理是在没有氧气的情况下，微生物降解有机物的过程。其相对好氧生物处理法的优点在于负荷高、运行费用低、污泥产量少、可回收能源等。在20世纪70年代，Lettinga等^[13]研制成功升流式厌氧污泥层反应器(Up-flow Anaerobic Sludge Bed，UASB)后，我国对采用UASB技术处理抗生素废水的工艺过程进行了大量的研究，发现UASB能较好处理庆大霉素^[14]、链霉素^[15]、盐酶素及粘杆酶素^[16]等抗生素废水。近年来，针对抗生素废水的厌氧生物处理方法和技术方面的研究仍在进行，大量改良工艺被开发并应用于工程实践。Sponza等^[17]发现使用多室厌氧流化床反应器能较好的处理土霉素废水，Chelliapan等^[18]发现使用上流式阶段厌氧反应器能较好的处理泰乐菌素废水，方玲玲等^[19]发现折流板反应器能较好的处理林可霉素废水。

（2）好氧生物处理法

好氧生物处理法是在有氧条件下，微生物降解有机物的过程。该方法需要大量曝气，耗费较多的能量，因此运行费用较高。由于抗生素废水的COD和氨氮负荷较高，即使在厌氧生物处理下有较高的COD和氨氮去除率，仍难满足出水标准，所以往往需要好氧生物处理进一步去除剩余COD和氨氮。好氧生物法处理抗生素废水的研究较多，常用方法包括序批式活性污泥法^[20]、周期循环活性污泥法^[21]、接触氧化法^[22]、氧化沟^[23]等。

1.4 膜生物反应器的特点及其应用

现有物化处理方法或生物处理方法难以实现抗生素废水的达标排放，且大多存在一次性投资高、运行成本高等问题。因此，研究更为高效、耐用、低运行成本的新型生物反应器，开发更有效的生物处理技术势在必行。膜生物反应器(Membrane Bio-Reactor, MBR)以其相较于传统的污泥处理工艺的优势，正逐步取得更多的关注和应用。

1.4.1膜生物反应器的特点

膜生物反应器是将膜分离技术与生物法结合的一类新型污水处理装置，其同时具有活性污泥法与膜分离技术的优点。近年来，世界各国研究人员对该工艺进行了广泛的研究。与传统工艺相比，其主要具有以下几点优势^[24]：

(1)剩余污泥少，且出水不需二沉池，能有效减少基建费用及污泥处理费用。

(2)生物量大，能处理较高负荷的废水。

(3)能保留住世代时间较长的硝化菌属，提高对氨氮的去除效果。

(4)运行稳定，即使发生污泥膨胀等情况，也能有较好的处理效果。

1.4.2膜生物反应器的应用

抗生素废水中污染物的负荷高，且具有较高的生物毒性，能抑制某些微生物的生长、繁殖，并容易引起污泥膨胀^[25]。MBR反应器的优点表明其适合用来处理抗生素废水，但由于其存在能耗较高、膜易污染、操作复杂、运行成本高等缺点，目前在实际应用中较少。不过随着对膜污染及膜材质研究的深入及排放标准的提高，MBR反应器在未来处理抗生素废水中有望发挥重要的作用。因此，目前对其处理抗生素废水的研究较多。Cheng等^[26]研究了MBR反应器对泰能（亚胺培南西司他丁钠）生产废水的处理效果，研究表明其对COD的去除率能达到96.0%。Wang等^[27]研究了氧化沟与MBR反应器对螺旋霉素生产废水的处理效果，研究表明MBR反应器与氧化沟对COD去除效果相似，但MBR反应器对氨氮及总磷的去除效果要明显强于氧化沟。此外，还发现MBR反应器对螺旋霉素的去除率能达到95%以上。鲁平等^[28]研究了一体式中空纤维膜MBR反应器对青霉素生产废水的处理效果，结果发现COD和氨氮去除率分别可达98%和87%。Tambosi等^[29]研究了MBR反应器对罗红霉素，磺胺甲恶唑，甲氧苄氨嘧啶的去除效果，结果发现MBR反应器污泥停留时间为30天时，对磺胺甲恶唑去除率可达64%，对罗红霉素的去除率为81%，对甲氧苄氨嘧啶的去除率为94%。

1.5 微生物强化技术

微生物强化技术是指通过向生物处理系统中投加从自然界中筛选的优势菌种或通过基因组合技术产生的高效菌种，强化去除某一种或某一类有害物质的方法，其可有效改善生物处理系统的处理效果^[30]。近年来该技术已经在化工、农药等工业废水处理中得到了广泛应用，但在抗生素废水处理方面的应用还鲜有报道。微生物强化技术可针对某一类特定的抗生素废水，筛选出对应的高效微生物来提高处理效果，但其在应用过程中可能会出现高效微生物“水土不服”的现象，如工艺、水质等条件的改变就可能会使这些菌株失去效果。因此从各种工艺及操作参数下筛选出高效菌株形成复合菌剂是抗生素废水处理的未来研究的方向之一。

1.6 分子生物学在生物处理技术的应用

废水生物处理系统中有着复杂的微生物菌群结构，其构成与污染物及生存环境条件之间存在密切的关系^[31]。因此，通过探究不同生物处理系统中微生物的菌群结构、多样性及功能的特点，可进一步阐明生物处理系统的处理过程，从而对其优化调控及稳定运行提供理论指导。传统分离培养法是在研究初期主要使用的方法。由于目前可培养的微生物仅占已发现微生物的1%，所以这一方法有很大的局限性^[32]。上世纪90年代，以核酸及蛋白质为基础的分子生物学技术被引入环境微生物研究领域，由于可以快速提供准确且全面的结果，迅速成为一种研究环境微生物主要方法。

1.6.1传统分子生物学技术在生物处理技术的应用

传统分子生物学技术研究微生物菌群结构的方法主要包括：温度/变性梯度凝胶电泳(Temperature/Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，T/DGGE)、限制性片段多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、荧光原位杂交(Fluorescence In-Situ Hybridization，FISH)等。近年来，许多研究者通过这些方法，使我们进一步了解生物处理系统中的微生物菌群结构。

（1）T/DGGE在生物处理技术的应用

T/DGGE原理是依据不同序列产物在同一浓度变性剂中变性温度/解链程度不同，使相同片段大小的双链DNA分开，形成可反映微生物菌群结构和多样性的指纹图谱。Qiu等^[33]通过此技术研究了黄连素废水处理MBR中微生物种群的变化情况，结果发现Sphingomonassp、Flavobacteriumsp等在运行过程中丰度升高。

（2）RFLP在生物处理技术的应用

RFLP是利用限制性核酸内切酶将DNA切成不同大小片段，通过电泳图谱来分析其微生物多样性。Whang等^[34]通过该技术研究了MBR反应器中硝化细菌的分布，结果发现在MBR反应器中亚硝化单胞菌（Nitrosomonas）是主要的氨氧化细菌(Ammonia-Oxidizing Bacteria，AOB)，硝酸菌（Nitrobacter）和硝化螺旋菌（Nitrospira）是主要的亚硝酸盐氧化细菌(Nitrite-Oxidizing Bacteria，NOB)，且在低亚硝酸盐MBR反应器中硝化螺旋菌（Nitrospira）丰度更高。

（3）FISH在生物处理技术的应用

FISH是利用荧光标记的DNA或RNA探针与相应靶核酸序列杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光显微镜下观察荧光信号来确定特定微生物的丰度。杨小丽等^[35]通过该技术研究了不同氨氮负荷下MBR反应器中微生物菌群结构，结果发现随着氨氮负荷的提高，α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌的丰度呈上升趋势，β-变形菌纲(Betaproteobacteria)的丰度呈下降趋势。

1.6.2第二代高通量测序技术在生物处理技术的应用

随着对生物处理系统研究的深入，传统分子生物学技术暴露出通量小、操作繁琐、灵敏度低等缺陷，第二代高通量测序技术可有效弥补其缺陷^[36]。第二代高通量测序技术可一次对上百万条DNA序列进行测序，其通量不仅可以满足微生物菌群结构及多样性的分析^[37]，还可以对微生物种群的功能进行研究^{[38, 39]}。近年来，在对生物处理系统的研究中，使用较多的测序技术为454焦磷酸测序和Illumina测序。

（1）454焦磷酸测序在生物处理技术的应用

454焦磷酸测序是最早出现的二代测序技术，其在环境微生物领域得到了广泛的使用。Zhang等^[40]通过该方法研究了世界各地市政废水厂的菌群结构，发现了多种报道较少的核心菌群，如Prosthecobacter，Caldilinea，Tricoccus等。Ibarbalz等^[41]通过该方法研究了工业废水与市政废水处理厂中微生物菌群结构的特征，结果发现进水水质、溶解氧和pH的差异会导致微生物菌群结构产生较大变化。

（2）Illumina测序在生物处理技术的应用

随着Illumina测序的出现，由于其通量更大、准确性更高、成本更低,因此逐渐取代454焦磷酸测序成为最主要的研究手段。IIIumina测序包括Hiseq和Miseq两个测序平台，二者测序的原理相同，但是HiSeq的测序通量远大于MiSeq，而MiSeq的测序耗时明显短于HiSeq。以Hiseq为例，它是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理，测序时将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即Flow cell），这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在Flow cell上形成了数以亿计Cluster，每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的SBS（边合成边测序）技术对待测的模板DNA进行测序。Illumina公司的新一代测序仪Hiseq 2000和Hiseq 2500具有高准确性、高通量、高灵敏度和低运行成本等突出优势，可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。

Meng等^[42]通过Illumina测序的方法研究了加入氟喹诺酮后MBR反应器中微生物菌群及硝化菌的变化，结果发现加入氟喹诺酮后，变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的丰度会呈上升趋势，且硝化菌在4周后就可以很好的适应氟喹诺酮。Ye等^[43]通过该方法研究了实验室与工程生物处理系统中微生物的菌群结构，功能及代谢通路，结果发现在两个系统中氨氧化细菌的丰度均远高于氨氧化古菌，且共享了73%的功能基因，但是碳代谢及膜转运通路有一定差异。

1.7 研究内容、目的与意义

1.7.1研究目的及意义

抗生素废水由于具有成分复杂、可生物化性差、生物毒性高等特点，导致其生物处理效果往往不够理想。随着废水排放标准的日益严苛，如何提高对抗生素废水的生物处理效果是目前水处理研究的热点，也是解决制约制药行业发展瓶颈的关键。好氧生物处理系统一般位于生物处理系统的末尾，其处理效果的好坏对整体处理效果起到至关重要的作用，故探寻高效、低运行成本的抗生素废水好氧生物处理技术显得尤其重要。

近年来，国内对抗生素废水好氧生物处理展开了大量研究，有多种工艺或工艺组合运用于工程实践，也大致了解了其微生物机理，但仍有诸多不足之处。第一，缺少对新型好氧生物处理工艺，如MBR反应器处理抗生素废水的研究，使得在处理抗生素废水选择工艺时，缺乏相应的设计依据；第二，缺少对新型好氧生物处理工艺的微生物学机理研究，使得新型工艺的调控主要依靠以往经验；第三，缺乏对抗生素废水好氧生物处理系统的核心菌群及功能菌群的研究，微生物处理的过程仍是“黑箱”；第四，缺乏对伴随水质条件变化的微生物菌群结构变化的研究，微生物菌群结构的演替规律尚不明确。

所以研究目的为：

(1)研究MBR反应器对高氨氮抗生素(青霉素)废水的处理效果，以期为高氨氮抗生素废水的工艺选择提供依据。

(2)研究不同氨氮负荷下MBR反应器中微生物菌群结构的变化，为抗生素废水处理工艺的调控提供技术支撑。

1.7.2研究内容

(1)逐步提高氨氮负荷，通过检测常规水质指标，研究MBR反应器在不同进水氨氮负荷下的运行稳定性；

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