黄曲霉素AFB1的电化学免疫传感研究

 2022-02-07 04:02

论文总字数:31469字

摘 要

黄曲霉素(Aflatoxins,AFTs)是自然界中存在的主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的曲霉毒素,在食品和农产品中广泛分布。因为它们极高的毒性和致癌性,食品中黄曲霉素的控制和检测吸引了许多国家的关注。人们已经发现了20种黄曲霉素,其中AFB1的分布最广,毒性最强。到目前为止,多种不同的方法应用于黄曲霉素的检测,电化学免疫传感器因为其灵敏度高、成本低和简便的优点而成为了这个领域的有力工具。

在此项工作中,我们构建了一种基于氧化石墨烯(GO)、普鲁士蓝(PB)和PTC-NH2(一种3,4,9,10-苝四羧酸二酐的氨化产物)纳米复合物的新型电化学免疫传感器,用来检测AFB1。在GO–PB–PTC-NH2修饰的玻碳电极(GCE)上组装金纳米颗粒(AuNPs)以提高传感器的灵敏度。然后在GO-PB-PTC-NH2/Au/GCE上组装1.5 mg mL-1 抗体(AFB70, Nb)和0.5% 牛血清白蛋白(BSA),并在0.01 M PBS(pH=6.0)中用差分脉冲伏安法(DPV)检测不同浓度的抗原AFB1(0.01 ng mL-1 to 2000 ng mL-1)。

用循环伏安法(CV)表征电化学免疫传感器的组装,结果表明AuNPs促进了电子的转移,提高了传感器的灵敏度,并且GO-PB-PTC-NH2, AuNPs, Nb, BSA 和AFB1成功地吸附在了电极表面。除此之外,我们用扫描电化学显微镜(SECM)、UV-vis和CV对PB, GO-PB 和GO-PB-PTC-NH2纳米复合物进行表征,结果表明PB和PTC-NH2成功附着在GO片层上,PB是此传感器的电子传递介质,PTC-NH2增强了PB的氧化还原峰。然后,我们测定了最佳的实验条件。最后,我们对不同浓度的AFB1进行了检测并获得了校准曲线。实验数据证明此电化学免疫传感器可以灵敏地检测低浓度的AFB1。

关键字:黄曲霉素B1;电化学免疫传感器;氧化石墨烯;普鲁士蓝;PTC-NH2;金纳米颗粒

The electrochemical immunosensor of Aflatoxin B1

41112102 Chen Song supervisor:Yanfei Shen

ABSTRACT

Aflatoxins(AFTs) are naturally existing mycotoxins produced mainly by Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus, present in a wide range of food and agricultural products. Because of their extremely high toxicity and carcinogenicity, the control and detection of aflatoxins in foodstuff take attention of many countries. 20 AFTs have been identified, and AFB1 is the most widespread and it is the most toxic among them. So far, different methods have been used for detection of aflatoxins, electrochemical immunosensors are powerful tools in this field owing to their high sensitivity, low cost and simplicity.

In this work, a novel electrochemical immunosensor is fabricated based on agraphite oxide(GO), Prussian blue(PB), and PTC-NH2(an ammonolysis product of 3,4,9,10-perylenetetracarboxylic dianhydride) nanocomposite for the selective detection of AFB1. Gold nanoparticles(AuNPs) are assembled on the GO-PB-PTC-NH2 modified glassy carbon electrode(GCE) to increase the sensitivity of this sensor. Then 1.5 mg mL-1 antibodies(AFB70, Nb) and 0.5% bovine serum albumin(BSA) are immobilized on GO-PB-PTC-NH2/Au/GCE to detect antigens(AFB1) of different concentration(0.01 ng mL-1 to 2000 ng mL-1) in 0.01 M PBS(pH=6.0) using differential pulse voltammetry(DPV).

The assembly of this electrochemical immunosensor is characterized by cyclic voltammograms(CV), the results indicates that AuNPs promote electron transfer and increase sensitivity of our sensor, and that GO-PB-PTC-NH2, AuNPs, Nb, BSA and AFB1 are adsorbed on the electrode successfully. In addition, PB, GO-PB and GO-PB-PTC-NH2 nanocomposites are characterized by scanning electrochemical microscope(SECM), UV-vis and CV, showing that PB and PTC-NH2 are successfully immobilized on GO sheets. Moreover, these results also imply that PB is an electron transfer mediator in our sensor and PTC-NH2 can amplify the redox peaks of PB. Then, optimal experimental conditions are investigated. Finally, AFB1 of different concentrations are detect and calibration curve is achieved. Our experimental data reveals that this electrochemical immunosensor can be used to detect AFB1 of low concentration sensitively.

Key words: Aflatoxin B1; Electrochemical immunosensor; Agraphite oxide; Prussian blue; PTC-NH2; Gold nanoparticles

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

目 录 1

第一章 绪论 3

0.引言 3

1.1 电化学免疫分析 3

1.2 基于石墨烯的电化学免疫分析 4

1.2.1 石墨烯作为电化学免疫分析的导电电极表面 4

1.2.2 石墨烯作为电化学免疫分析中免疫反应物的支持物 4

1.2.3 石墨烯作为电化学分析中的标记物纳米载体 5

1.3 基于金属纳米颗粒的电化学免疫分析 5

1.3.1 贵金属纳米颗粒作为电化学免疫分析的基质 5

1.3.2 贵金属纳米颗粒作为电化学免疫分析的标记物 6

1.4 黄曲霉素的毒性及检测 7

1.4.1 黄曲霉素的简介 7

1.4.2 黄曲霉素的毒性和致癌性 7

1.4.3 黄曲霉素检测方法 8

1.5 前景与展望 12

1.6 本研究的方案构思 12

第二章 实验材料和方法 13

2.1 实验材料与试剂 13

2.2 仪器与设备 14

2.3 实验方法 15

2.3.1 2 mM K3Fe(CN)6溶液的配制 15

2.3.2 PTC-NH2的制备 15

2.3.3 PB、GO-PB、GO-PB-PTC-NH2纳米复合材料的制备 16

2.3.4 金纳米颗粒(AuNPs)的制备 16

2.3.5 扫描电化学显微镜(SECM)观测纳米材料 17

2.3.6 紫外可见吸收光谱(UV-Vis)检测纳米复合材料 17

2.3.7 玻碳电极的打磨方法 17

2.3.8 PB、GO-PB、GO-PB-PTC-NH2纳米复合材料的电化学表征 18

2.3.9 AFB1电化学免疫传感器的构建 18

2.3.10 监测电化学免疫传感器的组装 19

第三章 结果与分析 20

3.1 所制备的纳米材料的结构和形态学表征 20

3.1.1 GO、GO-PB、GO-PB-PTC-NH2和金纳米颗粒的SECM表征 20

3.1.2 GO、GO-PB、GO-PB-PTC-NH2的紫外可见吸收光谱 21

3.1.3 GO-PB、GO-PB-PTC-NH2纳米复合材料的电化学表征 22

3.2 AFB1电化学免疫传感器的组装监测过程 23

3.3 实验条件的优化 23

3.4 AFB1的检测和分析 25

第四章 结论 26

参考文献 27

致谢 32

  1. 绪论

0.引言

免疫分析可以分为热量免疫传感器、光学免疫传感器、电化学免疫传感器和质量免疫传感器四种类型。电化学免疫传感器将抗原和抗体的特异性反应和电化学原理有机结合,能够通过电化学传感元件将化学或生物分子浓度信息转变为电信号,并且可以进行信号放大,检测痕量物质。因此,电化学免疫传感器既具有生物传感器种类多、成本低、选择性好、可与计算机相连的优点,又具有电化学分析体积小、简便、快速、设备简单的优点,目前正逐渐被应用于食品药品检验、环境监测等领域。

黄曲霉素(Aflatoxins,AFTs)是最重要的霉菌毒素之一,目前已分离出20中黄曲霉素,它们是二氢呋喃香豆素的衍生物,但在结构上有细微的差别,结构中的二氢呋喃环末端带有双键的黄曲霉素毒性较强,其中黄曲霉素B1(AFB1)的毒性最强,其毒性是砒霜的68 倍,其致癌性是二甲基亚硝胺的75 倍。人体通过饮食接触该毒素,可引发中毒和癌症,因此黄曲霉素的检测方法一直受到人们的关注,现在主要的检测方法有层析法、酶免疫分析法、光学免疫分析和电化学免疫分析等。

1.1 电化学免疫分析

免疫分析(Immunoassay)是一种运用特异性的抗体来识别和结合对应的抗原,并以此进行分析的生物化学检测技术[1]。为了获得可检测的信号,人们引用了可以形成检测信号的标记物,现在不同类型的标记物已经在免疫分析上得到了应用,包括酶、发色团、荧光团和电化学探针。免疫分析的核心是抗原和抗体之间的特异性和选择性,因此,具有高选择性和灵敏度的免疫分析法被认为是临床诊断中非常重要和有意义的分析技术。电化学分析法因其便捷、成本低、反应快和灵敏度高的优点引起了广泛关注。毋庸置疑,电化学分析法已经成为了许多领域的有力工具,例如疾病诊断、食品检测、环境监测等等。电化学免疫分析法结合了免疫分析法和电化学分析法,表现出了超出以上两种方法的优点,并适合应用于原位检测[2,3]

1.2 基于石墨烯的电化学免疫分析

在电化学传感器中,新型纳米材料因为其较高的导电性、较大的比表面积和良好的机械性能而被用于修饰新型性能优良的电极。石墨烯是一种二维纳米材料,具有独特的结构和物理性质,极好的电子转移能力,大的表面面积,良好的导电性和生物相容性。石墨烯的合成方法在过去的几十年中已得到了快速发展,包括机械脱落法、化学和电化学还原法以及化学蒸汽法,并且已经在实际应用中发展成熟。

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