论文总字数：13327字

摘 要

通过观察泡核桃青皮提取物1,2,4,6-Tetragalloyl glucose对结肠癌细胞存活率的影响, 为1,2,4,6-Tetragalloyl glucose治疗结肠癌提供一定的理论依据，以探讨其对人类结肠癌药物治疗的机制。 方法 体外培养肿瘤细胞株HT-29,A549, PC3, HePG2 和人正常细胞株HEK293，从泡核桃青皮中分馏、萃取和纯化出1,2,4,6-没食子酰葡萄糖（1,2,4,6-Tetragalloyl glucose），采用不同浓度的1,2,4,6-Tetragalloyl glucose（3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 g/ml）对结肠癌细胞株和人正常细胞进行干预，用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测其对人结肠癌细胞株存活率的影响。结果 MTT法检测1,2,4,6-Tetragalloyl glucose对结肠癌细胞株存活率的具有抑制作用，且对HT29细胞株抑制最为明显。结论 从泡核桃青皮中提取的1,2,4,6-Tetragalloyl glucose对体外培养的结肠癌细胞存活率有明显抑制作用，具体作用机制有待进一步研究。

关键词： 1,2,4,6-Tetragalloyl glucose，结肠癌细胞，MTT法，萃取

Abstract：Objective It provided a theoretical basis for 1,2,4,6-Tetragalloyl glucose treatment of colon cancer by observing the its effect on the viability of colon cancer cells and to investigate the mechanisms of human colon cancer drug therapy. Methods We culture colon cancer cell lines HT-29, A549, PC3, HePG2 (full name,except HT-29, other cell lines were not human colon cancer cell, please CHECK IT) and normal human cell lines HEK293. Extraction, fractionation, and purification of galloyltannins from seed husks of J. sigillata was carried out under activity-guide way. The cytotoxicity of different concentrations of 1,2,4,6-Tetragalloyl glucose (3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 g / ml) were investigated by tetrazolium salt (MTT) assay, moreover, the apoptic rate was investigated by flow cytometry. Result 1,2,4,6-Tetragalloyl glucose inhibited the cell viability of colon cancer cell lines in a concentration-dependent manner. Conclusion 1,2,4,6-Tetragalloyl glucose significantly inhibited colon cancer cell survival in vitro. Mechanism needs further study in detail.

Keywords：1,2,4,6-Tetragalloyl glucose, Colon cancer cells, MTT assay, apoptosis

目 录

1 前言 2

1.1 泡核桃简介 2

1.1.1泡核桃功效 3

1.2 关于结肠癌的认识 4

1.2.1结肠癌的发病机理 4

1.2.2 结肠癌的治疗 4

2 材料与方法 5

2.1 材料 5

2.1.1 实验材料 5

2.1.2 实验主要试剂 5

2.1.3 实验主要仪器 5

2.2 方法 5

2.2.1 原材料的分馏萃取 5

2.2.2结肠癌细胞培养 6

2.2.3 MTT法检测粗提取物B1~B6对结肠癌细胞株增殖的抑制作用 6

2.2.4 MTT法检测 1,2,4,6-Tetragalloyl glucose对结肠癌细胞增殖的抑制作用 8

2.2.5 不同浓度1,2,4,6-Tetragalloyl glucose对HT-29细胞活性的影响 8

2.2.6 Annexin V-FITC染色法检测细胞凋亡率 8

3 结果与分析 8

3.1检测粗提取物B1~B6对结肠癌细胞株增殖的抑制作用 8

3.2 1,2,4,6-Tetragalloyl glucose对结肠癌细胞增殖的抑制作用 9

3.3 不同浓度1,2,4,6-Tetragalloyl glucose对HT-29细胞活性的影响 10

3.4 用流式细胞仪检测细胞凋亡率 11

结 论 12

参 考 文 献 13

致 谢 15

前言

1.1 泡核桃简介

泡核桃（J.sigillata Dode）起源于云南、四川、西藏等省（自治区），其中地处滇西的漾濞县占有重要位置。西藏农牧科学院以及中国农业科学院的学者于20世纪80年代通过对泡核桃分布地区考察以后发现，泡核桃属乔木，树皮灰色，浅纵裂；小枝青灰色，有白色皮孔，二年生枝色稍深。冬芽卵圆形，芽鳞有短柔毛。单数羽状复叶，稀顶生小叶退化，长15~50 cm，叶轴及叶柄有黄褐色短柔毛；小叶通常9-11(稀15)枚，卵状披针形或椭圆状披针形，长6~18 cm，宽3~7 cm，顶端渐尖，基部歪斜，侧脉17-23对，下面脉腋簇生柔毛。雄花序粗壮，长13.5~19 cm ，雌花序具1-3雌花，花序轴密生腺毛。果倒卵圆形或近球形，长3.4~6 cm，径 3~5 cm，幼时有黄褐色绒毛，成熟时变无毛；果核倒卵形，长2.5~5 cm，径2~3 cm，两侧稍扁，表面具皱曲。花期3~4月，果期9月。在西藏，不仅有核桃(J.regia L)和泡核桃(J.sigillata Dode)的原始群落，而且还有栽培类型。

1.1.1泡核桃功效

泡核桃仁营养丰富，含脂肪、蛋白质和多种无机盐，具有健胃、补血、润肺、益肾和补脑等多种功能，是一种很好的滋补品。据《本草纲目》记载，核桃仁能“补气养血，润燥化痰，温肺润肠，治虚寒喘咳”。传统中医常用核桃仁入药，主治肾虚耳鸣、腰膝酸软、虚寒咳喘、肠风血痢、痈疽肿毒、遗精阳痿、中耳发炎等。将核桃仁微炒，与黄酒服用，还可以治疗腰痛是我国西南适宜种植地区的重要经济树种。但是很多人会把泡核桃青皮作为废弃物处理掉，但其中含有丰富的药用价值。核桃具有抗肿瘤作用^[1]。据资料记载，核桃叶、枝、青皮、树皮都有药用价值，具有消毒、杀菌、滋补、利尿、解毒等药效^[2~4]。研究人员发现核桃青皮提取物对小鼠lewis肺癌细胞生长的具有抑制作用^[5]，对于食管癌细胞增殖也具有抑制作用^[6]，此外研究还发现青皮提取物对于免疫系统还具有一定的调节作用^[7]。本文就探讨泡核桃是否对于结肠癌细胞也具有抑制作用，为结肠癌的治疗提供理论依据。

天然药材凭借其“副作用小，治病治本，经济实惠”的自身优点越来越受到人们的喜爱。但天然药材中化学成分十分复杂，一种单味药本身就是复杂混合物，复方中的化学成分就更加复杂；天然药材中有效成分含量极低，加上提取过程中有些化学成分相互作用，含量发生很大变化，因此，天然药材检测手段的选择与质量标准的制定有很大困难。天然药材分析一般要通过样品制备（提取、纯化、浓缩）和分析检测（鉴别、检查、含量测定）等步骤完成^[8]，采用分馏萃取的方法从泡核桃青皮中提取出粗提取物，并对其进行活性检测，从活性较高的粗提取物中再提取出抑制结肠癌细胞的物质。研究人员发现从核桃青皮粗提物和核桃青皮提取物没食子酸、乙酸乙酯均能抑制食管癌细胞的增殖^[9]，且抑制作用随着浓度的增加而增强^[10]，对泡核桃青皮醇提取物或提活性部位的研究发现，探讨其对结肠癌临床应用中同样具有医疗的作用。

1.2 关于结肠癌的认识

恶性肿瘤是一类危及全世界人民生命的严重疾病，目前针对恶性肿瘤的治疗方法主要包括外科手术、放疗和化疗等^[11]。结肠癌在恶性肿瘤中的发病率呈逐年上升的趋势。在欧美经济发达国家，居内脏恶性肿瘤的第一、二位，年发病率高达（35~50）/ 10万人；在我国，其发病率与死亡率约占常见恶性肿瘤的第六位。本病的发病年龄以40~60 岁居多，但 21~40 岁的青年患者亦占相当比例，约 40%。

1.2.1结肠癌的发病机理

我国传统医学中并没有关于结肠癌的直接描述，但诸多文献皆有相关论述，中医认为其发病原因有外因及内因两方面，外因有寒气客于肠外，或久坐湿地，或饮食不节，姿食肥腻，醇酒厚味等；内因之于忧思抑郁，脾胃失和而致湿热邪毒蕴结。而西医学研究其发病原因仍不确定，但流行病学认为其发病与生活方式(尤其是饮食习惯、缺乏体育锻炼)、社会环境、遗传等因素密切相关^[12]。

1.2.2 结肠癌的治疗

结肠癌的治疗以手术切除癌肿为首选，辅之以放射治疗、化学治疗及中医药治疗等，结肠癌尽管在手术、化疗和放疗等方面取得了一定的进展，但预后不佳，相当数量的患者最终死于癌灶的复发和转移^[13]。因此，有必要寻找其它的辅助治疗手段以提高结肠癌治疗效果。寻找疗效好、副作用少的药物，是临床的要求所在。目前天然药物对于一些癌症，恶性肿瘤的治疗已经颇有成效，中医从“虚”、“毒”、“湿”、“瘀”、“痰”等几个方面来考虑，中药作为放疗辅助用药应用于恶性肿瘤的治疗，具有多靶点、多效性的特点，毒副反应少，例如苦参碱是从豆科植物苦参的干燥根中提取的主要生物碱之一，近年来发现其能够诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖而发挥抗肿瘤作用^[14]。对于检测药物对结肠癌细胞活性的影响，目前最为方便、快速的方法是采用MTT法实验，具有灵敏度高、经济等优势^[15]，检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶物甲瓒(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能^[2]。本研究选用四种结肠癌细胞株（HT-29,A549, PC3, HePG2）和人正常细胞株 HEK293 作为研究对象，用泡核桃青皮提取物来干预其生长。观察不同粗提取物对体外培养结肠癌细胞株生长的影响，从中进一步提取出1,2,4,6-Tetragalloyl glucose，并用不同浓度进行干预结肠癌细胞的生长，检测细胞凋亡率^[16]。为1,2,4,6-Tetragalloyl glucose治疗结肠癌提供一定的理论依据，以探讨1,2,4,6-Tetragalloyl glucose对结肠癌化学治疗的机制。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验材料

泡核桃青皮取自中国四川省绵阳市三台县；

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