胞外多糖生产菌发酵条件优化

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摘 要

本文对实验室的一株胞外多糖生产菌株P47进行发酵优化实验，通过单因素实验选出最优碳源和氮源,并在此基础上进行Placket-Burman实验设计对发酵培养基的6个因素进行筛选，结果表明对结果影响显著的四个因素为：木糖，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，硫酸铵。运用响应面分析得出P47产生多糖的最佳发酵条件为：木糖3%，酵母膏0.5%，硫酸铵0.1%，磷酸氢二钾1%，磷酸二氢钾0.4%，氯化钠0.1%。对菌株所产的多糖进行纯化以及单糖组分分析，从结果可以看出，当以木糖和葡萄糖为碳源发酵多糖时，发酵产生的多糖其单糖组成区别不大，主要的单糖组成为岩藻糖、葡萄糖和半乳糖，它们的摩尔比为1:1.06:1.42。

关键词：胞外多糖，发酵优化，Placket-Burman实验，响应面分析

Abstract:In this paper,single-factor test and response surface methodology (RSM) were adopted to optimize the fermentation conditions.By the basis of the single factor experiences to select the optimal carbon source and the nitrogen source, the Placket-Burman was used to select from the six factors.The results show that the four significant factors as follows:xylose, potassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate and ammonium sulfate.The optimum fermentation conditions for polysaccharide were obtained by the response surface methodology (RSM): 3% of xylose, 0.5% of yeast extract, 0.1% ammonium sulfate, 1% potassium phosphate, 0.4% potassium dihydrogen phosphate and 0.1% sodium chloride.The polysaccharide produced was finally purified and analysis of the monosaccharide component was carried out. As can be seen from the chromatogram, xylose and glucose as carbon source, polysaccharide fermentation to produce almost no difference, to determine the retention time of 6.65, 7.05, 7.70, peak corresponding fucose, glucose and galactose, the mole ratio of 1:1. 06:1. 42.

Keywords: exoplysaccharide, fermentation condition optimization, Placket-Burman, response surface methodology

目录

1.前 言 3

2.材料与方法 4

2.1实验材料 4

2.1.1菌种 4

2.1.2培养基 4

2.2实验方法 5

2.2.1碳源的优化 5

2.2.2有机氮源的优化 5

2.2.3无机氮源的优化 5

2.2.4 Placket-Burman实验 5

2.2.5响应面分析 5

2.2.6菌体浓度测定 5

2.2.7多糖的提取和产量的测定 6

2.2.8多糖的脱蛋白和单糖组成分析 6

2.2.9 离子色谱分析条件 7

3.实验结论与分析 7

3.1不同碳源对多糖产量的影响 7

3.2不同有机氮源对多糖产量的影响 8

3.3无机氮源对多糖产量的影响 8

3.4 Placket-Burman因素筛选实验 9

3.5响应面分析 10

3.6单糖组分分析 20

结论 22

参考文献 23

致谢 25

1.前 言

微生物多糖^[1]是细菌、真菌等微生物的代谢产物，主要包括胞壁多糖、胞内多糖和胞外多糖^[2]。其中胞外多糖^[3]是微生物生长过程中为适应环境而分泌到细胞外的粘液或者荚膜多糖，因其独特的和优良的物理特性得到广泛应用，但其成本高，产量低，无法进行发酵大规模工业化生产，所以需要对其进行条件优化，使其达到生产标准。

微生物胞外多糖的主要提取过程包括菌体细胞的去除^[4]、多糖的沉淀^[5]以及多糖的干燥^[6]。常用的多糖沉淀的方法有醇沉淀和盐沉淀法。由于醇能降低多糖与水分子间的亲和力使多糖分子脱水凝聚成沉淀物且能部分洗脱发酵液中的色素、盐类和细胞碎片，所以最常使用醇沉淀法来进行多糖提取^[7]。多糖沉淀之后实验室多采用冻干或者置于60℃干燥箱中进行干燥。利用有机溶剂和盐沉淀的多糖经沉淀后的多含蛋白质等杂质。常用的脱蛋白的方法包括Sevage法^[8]、三氯乙酸法^[9]、三氟乙烷法^[10]以及蛋白酶-Sevage法^[11]。其中三氯乙酸比较剧烈，并且损耗较多的有机溶剂，而Sevage法以及蛋白酶-Sevage法较为温和，蛋白去除率也高。

微生物胞外多糖相较其他多糖具有很大的优势：①生产周期短，不受季节、地域和病虫害条件限制，原料来源丰富廉价，成本较低，可以人工控制条件下利用各种废渣、废液并且进行大规模工业化生产；②微生物胞外多糖具有很多优良活性。比如抗肿瘤活性、抗氧化、免疫调节、降血糖和血脂、抗凝血等；③产糖量高，纯化简单，对环境无污染，因而具备较强的市场竞争力和广阔的发展前景。

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