浮萍Spirodela核糖体亚基5S间隔序列克隆及比对分析

论文总字数：6670字

摘 要

作为快速生长的小型水生植物，多年来浮萍被广泛应用于遗传学、植物生理学、环境检测和生态学等方面的研究。核糖体亚基5S rDNA 基因间隔区序列具有高度保守性可用于分析研究浮萍的种间差异。本研究通过基因克隆、比对核糖体亚基5S间隔区序列，以及非转录基因间隔序列间的差异，研究本地浮萍的生物多样性及其生物量积累与间隔区序列的关系。

关键词：浮萍，基因克隆，序列比对，生物多样性

Abstract: As a small aquatic plant with fast-growing, duckweed has been widely used for genetics, physiology, environmental testing and ecology many years. The 5S rDNA gene spacer sequence is conserved for analysis of inter-species differences in duckweed. In this study, the 5S rDNA non-transcribed gene gap sequence was used to clone and compare the 5S rDNA sequences of spirodela ribosomal subunits. The relationship between the biodiversity of the local duckweed and its biomass accumulation and the spacer sequence was studied.

Key words: duckweed, gene cloning, sequence alignment, biodiversity

目 录

1 前言 3

2 材料与方法 3

2.1 实验材料 3

2.1.1 材料 3

2.1.2 试剂 3

2.1.3 仪器与设备 4

2.2 实验方法 4

2.2.1 基因组总DNA提取 4

2.2.2 物种分析 4

2.2.3 目的基因扩增 5

3 结果分析 6

3.1 物种分析 6

3.1.1 Barcoding基因扩增 6

3.1.2 基因序列及BLAST序列比对 7

3.2 5S rDNA间隔区基因克隆 8

3.2.1 间隔区扩增分析 8

3.2.2 测序结果 8

3.3 不同物种间隔区序列比对 9

结 论 10

参 考 文 献 11

致 谢 12

1 前言

浮萍为水生漂浮植物，是世界上最小的开花植物，分布广泛，多生于水流相对平缓的沼泽、湖泊中。浮萍亚科有5属，38种^[1,2]，各属之间大体上可根据其根的数目和形状进行区分。各属完整植株都比较小，且结构简单，主要进行无性生殖，且生长周期短。浮萍易于培养，生产成本低，极易吸收溶解于水中的化合物，近年来浮萍被广泛运用于植物遗传学、生态学、污水治理和环境监测等方面的研究。浮萍科植物对污水中的重金属和氨等具有较高的耐受性，因此几乎所有的浮萍亚科植株均能在富含重金属等多种营养成分的污水中生长^[3]。与此同时，由于环境中的物种与环境的互作作用，浮萍多样性的生长也影响富营养化水体中水质指标及浮萍自身生物质的积累，研究表明，不同物种的浮萍搭配混养不但可提高富营养化水体净化效果，对于浮萍自身生物量的积累也具有一定的积极作用^[4]。与此同时，浮萍易受环境影响，也可以通过减少碳水化合物的消耗来抑制浮萍生长，从而诱导淀粉积累^[5]。

随着生物技术的发展，分子生物学被广泛应用于物种多样性研究，核糖体 rDNA 是其中常用的分子标记之一^[6]，核糖体5S亚基rDNA在进化过程中相对较为保守，该部分基因序列可作为鉴定各种生物的参考依据^[7]。基因间隔区序列分为转录和非转录基因间隔序列（NTS）两种，其中转录基因间隔序列又分为基因内部（ITS）和基因外部转录间隔序列ETS两类^[8]。核糖体亚基5S rDNA 基因间隔区序列保守性较高，较适于属内及属间不同层次的分类学研究^[9,10]。

本研究通过PCR技术对核糖体5S rDNA间隔序列进行基因扩增，使用ONLINE ANALYSIS TOOLS软件对基因序列进行比对分析，以寻找不同物种的浮萍5S rDNA非转录基因间隔序列间的差异，研究物种多样性，并通过5S rDNA间隔区的序列差异研究其与浮萍生长速度的关系。

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 材料

本研究所使用的四个实验材料样品由团队研究成员Anton Peterson取自中国中东部城市江苏省淮安市钵池山公园，该实验材料在实验室分别标记为M1, L, F4和G1。

2.1.2试剂

PCR引物由赛百盛基因技术有限公司合成；Solution I、pMD19-T Vector (50ng/μL)及各种限制性内切酶均购于宝生物工程有限公司(TaKaRa)；dNTPs(2.5mM)、Taq DNA Polymerase(5U/μL)、DL5000 DNA Marker、10×Taq酶反应缓冲溶液购于北京佳兰生物科技有限公司；大肠杆菌感受态细胞(Escherichia coli DH5a)由实验室冷冻保存；exDNA凝胶回收试剂盒由淮安百慧公司生产；DNA测序由上海生工测序部完成。

2.1.3 仪器与设备

PCR扩增仪（型号：GeneAmp®PCR System 9700）、上海跃进SW-CJ-2FD超净工作台、Eppendorf 5418R小型温控台式离心机、HZQ-F160全温振荡培养箱、DKZ-1型电热恒温振荡水槽、德国eppendorf 单道可调移液器、TE612-L电子天平、电泳槽、电泳仪、凝胶成像系统等。

2.2 实验方法

2.2.1基因组总DNA提取

改进的CTAB法抽提浮萍的基因组总DNA

（1）称取0. 2 g浮萍叶片置于2mL离心管中，加入600μl 已经预热到65℃的2×CTAB，混合均匀，使其充分裂解。

（2）将离心管放入恒温水浴箱中，65℃温育40分钟，期间颠倒混匀数次。

（3）加入等体积（600μl）的氯仿:异戊醇（24:1）。

（4）颠倒混匀约30分钟，室温下，4000rpm离心20分钟。

剩余内容已隐藏，请支付后下载全文，论文总字数：6670字