Frizzled9在耳蜗中的表达及其阳性细胞再生毛细胞的研究

论文总字数：27672字

摘 要

本文研究了Frizzled 9在小鼠耳蜗中的表达及其阳性细胞在体外增殖分化情况。

研究Frizzled 9在耳蜗中的时空表达，采用了RT-PCR的方法来检测不同时间点Frizzled 9在耳蜗中的表达。结果表明在小鼠发育早期阶段，即出生后第3天与第7天Frizzled9的表达量较高，随着发育到后期其表达量减少明显，至14天表达量减少至几乎完全消失。说明小鼠耳蜗中Frizzled 9的表达量随着发育进程逐渐减少，至发育完全后一般不再继续表达。

对耳蜗中的Frizzled 9阳性细胞进行流式分选并进行体外培养，研究这些细胞的增殖分化及再生毛细胞的能力。培养过程中的Frizzled 9阳性细胞至第二天起便有较为明显的成球现象，说明细胞已经开始增殖。培养后期经免疫荧光染色发现增殖中的细胞有毛细胞的特异性标记，表明Frizzled 9阳性细胞在体外能够分化成为毛细胞。另外，直接对耳蜗基底膜进行组织培养，培养过程在培养基中加入EdU、TM以及Wnt激动剂Bio，最终免疫荧光染色得到的结果显示正在增殖中的Frizzled 9阳性细胞新产生的为毛细胞。

综上所述，Frizzled 9阳性细胞在小鼠发育早期能够增殖分化形成毛细胞，可以作为毛细胞的祖细胞。

关键词：Frizzled 9，RT-PCR，毛细胞，增殖分化

ABSTRACT

In this thesis, we investigated the expression of Frizzled 9 in mouse cochlea and the proliferation and differentiation of positive cells in vitro.

To study the expression of Frizzled 9 in the cochlea, RT-PCR was used to detect the expression of Frizzled 9 in the cochlea at different time points. The results showed that the expression level of Frizzled9 was higher in the early stage of mouse development, and the expression level of Frizzled9 decreased significantly at the later stage of development. Indicating that the expression of Frizzled 9 in the cochlea of mice gradually decreased with the developmental process, and it was not always expressed after development.

Frizzled 9 positive cells in the cochlea were sorted by flow cytometry and cultured in vitro to study the proliferation and differentiation of these cells and the ability to regenerate hair cells. Almost in the next day of culture, frizzled 9-positive cells can form colonies, indicating that cells have begun to proliferate. At the later stage of culture, the cells were identified by immunofluorescence staining, indicating that Frizzled 9 positive cells could generate hair cells in vitro.

To conclude, in the early development of mice, Frizzled 9 positive cells, can proliferate and differentiate into hair cells, they can be the progenitor cells of hair cells.

Key words: Frizzled 9，RT-PCR，Hair Cells，Proliferation and differentiation

目 录

摘 要 III

ABSTRACT III

1 绪论 1

1.1引言 1

1.2耳蜗的形态、结构及其功能 1

1.3 Wnt信号通路在耳蜗毛细胞再生中的作用 2

1.4 Frizzled 9基因的研究现状 5

1.5本文的研究目的和主要研究内容 6

2 实验材料与实验方法 7

2.1实验材料 7

2.2动物实验方法 8

3 实验结果 12

3.1基因型鉴定结果 12

3.2 RT-PCR结果 13

3.3 Frizzled 9阳性细胞在体外增殖成球结果 15

3.4 Frizzled 9阳性细胞在体外增殖成球的免疫荧光结果 16

3.5 耳蜗基底膜体外组织培养后的免疫荧光染色结果 17

结 论 18

讨 论 19

参考文献 20

致 谢 22

1 绪论

1.1引言

感觉神经性听力损伤影响着世界上数百万人，其中内耳毛细胞的损伤占了绝大多数。内耳毛细胞的损伤原因常常是巨大的噪声环境、化学药物损伤、基因失序、年龄增长以及一些药物治疗等。传统对听力损伤的研究主要集中于外围保护以防止毛细胞的损伤、修复听力损伤从而刺激剩余毛细胞再生或者耳蜗移植等对听觉神经造成直接刺激的方式，近年来的研究中，内耳毛细胞再生、基因疗法以及信号调节已经成为实现毛细胞再生的几条主要途径。本实验研究内容即为毛细胞再生中其中一个基因Frizzled9在耳蜗中表达及其阳性细胞再生毛细胞的研究。

1.2耳蜗的形态、结构及其功能^[1-3][15]

耳蜗是内耳的主要听觉部分，于骨迷路中形成的一个螺旋形空腔，人类的耳蜗绕蜗轴2.5圈。耳蜗的核心部件是Corti器（柯替器），其在耳蜗的螺旋形锥形管中的流体腔室分隔分布。耳蜗是螺旋形、中空呈现圆锥形的骨腔，其中螺旋从基部（靠近中耳和椭圆窗）延伸到顶点（螺旋的顶部或中心）。耳蜗的螺旋管是内耳骨迷路中的一部分，长约30毫米，并且围绕轴线曲折形成2¾匝。

耳蜗结构包括：1）三个室：前庭管（包含外淋巴），高于耳蜗管并邻接椭圆窗；鼓膜鼓膜（包含外淋巴），低于耳蜗管并且终止于圆窗；耳蜗管（包含内淋巴）毛细胞的硬纤毛突入的一个高钾离子浓度区域；2）蜗孔：是在耳蜗顶端的螺旋体，位于鼓室和前庭管合并的位置；3）赖斯纳氏膜：将前庭管与耳蜗管分开；4）基底膜：将耳蜗管与鼓膜分离的主要结构元件，是确定耳蜗分隔物的机械波传播特性的主要部分；5）Corti器（螺旋器）：属于感觉上皮，基底膜上的细胞层，在其中感觉毛细胞由外淋巴和内淋巴之间的潜在差异驱动；6）毛细胞：Corti器中的感觉细胞，顶部呈毛状结构，称为纤毛细胞。

剩余内容已隐藏，请支付后下载全文，论文总字数：27672字