circRNA在氧化石墨烯致秀丽线虫体内毒性的调控作用研究

论文总字数：29432字

摘 要

Abstract 2

目录 1

绪论 5

第一章circRNA的研究进展 6

一．circRNA的形成 7

二 circRNA的功能 8

三．circRNA在疾病发生中的作用 10

四．展望 11

参考文献 12

第二章 circRNA在氧化石墨烯致秀丽线虫体内毒性的调控作用研究 15

1.实验方案 17

2. 实验材料及仪器 17

2.1 材料与仪器 17

2.2 主要试剂及溶液 16

3.实验方法 18

3.1 GO的制备 18

3.2秀丽线虫的培养 18

3.3 线虫同步化与暴露 19

3.4circRNA对GO 在秀丽线虫中转运和毒性的影响 20

3.5 候选靶基因调节GO 转运和毒性效应 21

第三章 结果分析 23

第四章 讨论与展望 32

致谢 33

绪论

石墨烯是一种二维碳纳米材，它是由碳原子以sp2 杂化轨道六角型呈蜂巢晶格料组成的, 具有优异生物医学和药物传递的功能，具有重要的应用前景, 被认为是非常具有革命性的材料。 随着石墨烯在人类产品中的广泛应用, 其生物安全性是否对人体有害问题也备受关注。 许多人认为石墨烯是一种生物安全性及生物相适应性良好的碳纳米材料, 部分研究却发现石墨烯可能具有一定的生物毒性. 石墨烯的生物毒性主要与其理化性质，列如大小、形状、表面电荷、使用剂量，可能具有一定的相关性。

近年来，对于氧化石墨烯的毒性研究有了很大的进展，在细胞中的研究，在秀丽线虫中的研究也非常多。

环状RNA(circular RNA，circRNA) 是近年来RNA研究领域最新的研究热点，它是由特殊的选择性剪切产生的，具有调控基因表达作用环形的内源性RNA，是一类不具有5'末端帽子和 3'末端 poly(A) 尾巴，并且以共价键形成呈封闭的环状结构的RNA 分子。由于circRNA稳定性强且circRNA作为一种调控分子进行调控miRNA功能。另外通过研究发现，circRNA 通过结合microRNA结合位点来发挥其竞争性内源RNA作用，我们称其为 miRNA海绵”。 本文将综述 circRNA 的研究进展。

模式生物是生物学家实验中用于探究某种普遍生命现象的生物物种。目前常见的模式生物有酵母、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、拟南芥等，这些生物在生命科学中发展起到了非常非常重要的作用。在他们当中，秀丽隐杆线虫作为一种模式生物具有其自身的优势，在遗传、细胞周期、毒性等方面的是一种非常理想的模式生物。

1900年，Maupas把这种棒状的蠕虫命名为Rhabditis elegans，因为群体繁殖为“r-选择”的缘故，早在1948年Dougherty and Calhoun 便指出了它在遗传学研究中的重要性。1952年，Osche把它置于Caenorhabditis亚属；1955年Dougherty最终把它命名为Caenorhabditis elegans（其中Caeno意为 recent; rhabditis意为 rod; elegans意为nice）。

我们至今广泛实验室使用的N2 Bristol品系，就是由Staniland从英格兰Bristol附近的蘑菇堆肥中分离，1965年被定为参考种N2。在此过程中，Dougherty建立了线虫的琼脂培养基培养及接种，用大肠杆菌为食物的培养方法和无大肠杆菌单培养方法。”

至此之后，他就决心去寻找一个新的通用的模式生物。1963年10月，他从Dougherty实验室获得了线虫Bristol品系。早期研究的修理线虫工作中，Brenner在培养基中分离得到了一些营养突变体，他因此转而使用EMS处理过的秀丽线虫，从而获得了一种比较短小矮胖的秀丽线虫，被命名为dpy-1。

到1974年Brenner的论文The Genetics of Caenorhabditis elegans发表时，通过EMS诱变秀丽线虫，一共获得了大约300多个秀丽线虫突变体，其中大多数为隐性基因突变。突变表型涉及行为、运动和形态结构等等各各方面，这些突变的秀丽线虫使得100多个他们的隐性或显性基因得以表征，并被定位于6个连锁基因群。秀丽线虫作为模式生物的优越性也被广大的科学家认可，例如如通体透明易观察，体细胞数目恒定，结构比较简单，特定细胞位置固定等，这使得它成为研究个体发生非常好的模式生物。

Sulston通过活体观察线虫的胚胎发育和细胞迁移途径，于1983年完成线虫从受精卵到成体的细胞谱系，是发育生物学史上具有里程碑性的发现，随后秀丽线虫在胚胎发育、性别决定、细胞凋亡、行为与神经生物学等方面研究中得到广泛应用。其中Brenner，Sulston和Horvitz获得2002年诺贝尔医学或生理学奖，主要是因为他们在线虫的遗传与发育方面取得的重要的研究成果。秀丽线虫基因组测序工作从1980年代中期开始，1998年完成。同一年Fire建立了线虫RNA干扰技术，即通过反向遗传学（reverse genetics）研究特定基因的功该技术可以十分方便的去沉默特定的基因，进而去研究这个沉默基因的功能，在生命科学的许多重要的领域都得到十分广泛的应用，因此在2006年Fire和Mello获得诺贝尔医学或生理学奖去表彰这项工作的成就。

在当今的实验研究当中，秀丽线虫因为他的基因组测序完成、基因图谱已被绘制，遗传背景十分清楚，早已被科学家们研究透彻和结构简单及个体结构简单所以细胞数为定数、生活史短、成本低等这些重要的因素，在自然条件下，秀丽线虫是雌雄通体的的一种模式生物，一生可以产生约300粒受精卵，可以快速大量繁殖。这一特征：在自然条件或诱导下，可以产生雄性个体来进行杂交实验，这项优势使得秀丽线虫在遗传学研究方面有着无可比拟的长处及其他生物不可比拟的优势。而修理线虫在遗传与发育生物学、行为与神经生物学、衰老与寿命、化学毒性等等领域得到非常广泛的应用，深受科学家的青睐，它成为了一种非常理想的模式动物。而我们从秀丽隐杆线虫自身独特的一些特点来想的话，这一点也从上世纪修理线虫的发现和使用开始来算，几十年的时光使人们对它的研究及以它为许多生物材料做出的研究成就中得以证实。另外，全部1090个细胞在秀丽线虫中，有131个细胞是以一种不变的方式，在固定的发育时间和固定位置消失或生长。秀丽线虫一定的细胞数目以及非常固定不变的的细胞凋亡和细胞死去是决定秀丽线虫在研究细胞凋亡方面地位处于非常重要的层面的主要原因。

我们的实验会将秀丽线虫及circRNA结合起来，进一步探索GO的毒性。本实验将野生型秀丽线虫分别在暴露与不暴露氧化石墨烯的情况下，利用新一代测序技术确定在氧化石墨烯暴露的秀丽线虫体内异常表达的circRNA。利用qRT-PCR技术验证差异表达的circRNA。运动行为、寿命和ROS 作为评价终点，利用RNAi和过表达circRNA技术分析差异表达的circRNA在调节氧化石墨烯致秀丽线虫体内毒性中所起到的作用； 预测与circRNA结合的miRNA，构建双突变秀丽线虫分析circRNA-miRNA互作在调节氧化石墨烯致秀丽线虫体内毒性时的分子机制。

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