纳米镍对秀丽线虫的生殖毒性作用

论文总字数：8234字

摘 要

以秀丽线虫为实验模型，对纳米镍的生殖毒性作用进行研究，为进一步研究纳米镍对机体的远期效应和制定纳米镍安全性评价标准提供参考。方法 将纳米镍分成低中高三个剂量组设置、抗氧化剂组、金属镍对照组，对秀丽线虫进行染毒，分别得到后代数目、世代时间、体内受精卵数和排受精卵速率四个指标的5组数据。对纳米镍生殖毒性进行评价。结果 纳米镍能降低线虫体内受精卵数目、延缓排受精卵速率，进而对秀丽线虫的后代数目和世代时间产生影响。结论 纳米镍对模式生物秀丽线虫具有一定的生殖毒性作用。

关键词：模式生物 纳米镍 秀丽线虫 生殖毒性

Reproductive toxicity of Nano nickel to Caenorhabditis elegans

Abstract: Objective The aim of this study is to investigate reproductive toxicity of nickel nano research using Caenorhabditis elegan(C elegans), for further study of nano nickel on the body of the long term effects and the development of nano nickel safety evaluation standards provide a reference. Methods First，C elegans were treated with 20 nm or 90 nm nickel nanoparticles at the doses of 0 、1.0ug/cm²、2．5ug/cm² and 5．0 ug/cm²，with 9 g/L NaCI treatment and 3 um nickel microparticle treatment as control groups．Then，the toxicity was detected by using a battery of biotests，including brood size，generation time，The rate of fertilized eggs and fertilized eggs in vivo． Results Nano nickel can reduce the number of Caenorhabditis elegans eggs in the nematode, the rate of the Caenorhabditis elegans eggs, and brood size，generation time.

Conclusion Nano nickel has a certain reproductive toxicity to Caenorhabditis elegan(C elegans).

Key words: model organism; Nano nickel;Caenorhabditis elegans ;Reproductive toxicity

自然界存在十多万种化合物，包括天然化合物和人造化合物。这些化合物是否会对人类健康产生不良影响?这需要大量的实验室工作和现场流行病学调查来证实。生殖系统对外源性化学物质非常敏感，迄今已有多种化学物质被证实具有生殖毒性。而随着我国不孕不育发病率的逐年升高，人们对生殖健康问题也给予了高度的关注。因此，对许多新发现和产生的外源化合物的生殖毒性的筛选和考察是目前亟待开展的工作。传统的生殖毒性检测是一项艰巨而繁重的工作, 通常以整体动物实验为主，包括分娩前发育毒性研究、一代和多代生殖毒性研究，生殖毒性/发育毒性筛选检测等，主要是从染毒到发育的整个过程中评价外源化学物对生殖功能造成的损伤，实验动物模型多采用大鼠或小鼠。如果按照传统的生殖发育毒性安全评价原则和方法来进行考察，不仅效率低、无法满足实际工作的需要，而且耗资较大。尽管整体动物实验在毒性评价时是不可缺少的，但由于动物与动物，以及动物与人之间存在着种属差异，使一些研究结果难以准确地进行推导。此外，从伦理学的角度考虑，应尽量减少动物的使用。因此，利用简单、快速的毒理学实验作为检验化学物质生殖毒性的筛选手段，建立快速、可靠的生殖毒性实验替代模型，一直是国际上毒理学界研究的热点方向。

近年来，秀丽线虫作为模式动物，越来越多地被应用到毒理学研究，尤其生殖毒理研究中。与传统实验动物大鼠或小鼠相比，线虫具有研究生殖毒性及其机制的优越性：线虫后代数目多，具有完整的生殖系统和简单的发育过程。线虫身体透明，体内生殖器官在普通光学显微镜下清晰可见，可以整体水平下观察外源性化学物质暴露对生殖器官的损伤^[1]。秀丽线虫基因组中约40%的基因在人基因组中有明显同源物存在。在生殖发育通路中，细胞凋亡通路关键基因在人基因组中都有同源物存在，两者的编码蛋白不但序列上具有相似性，而且功能上也极为保守。所以，利用秀丽线虫已有的生殖系统基因组资源和蛋白质组资源来研究外源性化学物质对雄、雌性生殖系统毒作用机制，在一定范围和程度上可以将结果外推到对哺乳动物的损伤^[2-3]。模式生物-秀丽线虫已经是本课题组建立起来的一个替代传统动物研究生殖毒性的模型。因此，本课题采用该模型对金属纳米镍的生殖毒性作用进行研究。

1材料与方法

1.1 线虫

秀丽隐杆线虫N2品系由中国科学院遗传与发育生物学研究所杨崇林课题组赠送。

1.2 仪器

生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司，型号：SHP-150）；水浴恒温振荡器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂，型号：SHZ-A）；体式显微镜（南京江南永新光学有限公司科学仪器分公司，型号：SE 2200）；激光粒度仪（英国Malvern公司，型号：Zetasizer Nano ZS90）；台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，型号：5417R）；多样品组织研磨机（上海尤释机电设备发展有限公司，型号：Tissuelyser-24）。

1.3 试剂配制

1.3.1 NGM培养基：氯化钠3 g，多聚蛋白胨2.5 g，琼脂17 g，用蒸馏水溶解至1L，高压灭菌。置水浴锅冷却至55℃左右，超净工作台内加入1ml 1M 氯化钙，1ml 1M 硫酸镁，1ml 5 mg/L胆固醇，25ml 1M磷酸钾缓冲液，混匀后倒入培养皿内。

1.3.2 L Broth液体培养基：氯化钠 5 g，胰蛋白胨10 g，酵母抽提物5 g，用蒸馏水溶解至1 L，pH 7.0，高压灭菌。

1.3.3 M9 缓冲液：磷酸氢二钠6 g，磷酸二氢钾3 g，氯化钠5 g，1 M硫酸镁1 ml，用蒸馏水溶解1 L，高压灭菌。

1.3.4 线虫裂解液：5M 氢氧化钠100 μl，次氯酸钠50 μl，蒸馏水850 μl，临用时配制。

1.3.5 卵子缓冲液：氯化钠6.896 g，氯化钾3.578 g，二水氯化钙0.294 g，六水氯化镁0.406 g，HEPES 5.958 g，用蒸馏水溶解并定容至1 L。

1.4 暴露方法

用生理盐水将纳米镍等配成一定浓度的混悬液，加入到每个培养皿中，等生理盐水挥发或浸入到NGM培养基后，纳米镍和微米镍就沉积下来，均匀分散在培养基表层。实验采用的质量分布为0 μg/cm²、1.0 μg/cm²、2.5 μg/cm²、5.0 μg/cm²纳米镍，微米镍为5.0 μg/cm²，另设抗氧化剂组，即在5.0 μg/cm²纳米镍的培养皿中，每8小时加0.5 g/L维生素C的无菌水200 μl，使NGM培养基表层保持微润；0 μg/cm²组在培养皿中加入相应体积的生理盐水。暴露前一天按上述方法将纳米镍等各培养皿制好。

1.5 后代数目和世代时间的测定

参考Swain等^[4]报道，后代数目（Brood size）是指当代线虫（P0）发育为成虫后所产生的所有的后代数目。测定方法：将一条L4期线虫放入一个培养皿中，各组的测定数目为10条线虫，暴露72h；产卵时要一天换一次培养皿，若暴露期间产卵，换培养皿时注意换上含纳米镍的培养皿，保证暴露72h；计算所有换下的培养皿中线虫数目。

世代时间是指从P0代成虫产卵到其卵即F1代发育到成虫产卵的时间间隔（Generation time）。测定方法：将L4期线虫挑到不同组别的培养皿中，各组的测定数目为10条线虫，暴露48h；观察线虫产第一个卵的时间（t0），把第一个卵移至一个新的NGM培养皿中，观察这个卵经孵化后长成成虫，然后产第一个卵的时间（t1），世代时间＝t1~t0。

1.6 体内受精卵数和体外排受精卵速率测定

体内受精卵数：将L4期线虫挑到不同组别的培养皿中，各剂量组的线虫数目为20条，分别暴露24、48、72 h后。将暴露线虫挑至无OP50的NGM培养皿上，向虫体上滴加线虫裂解液，使虫体消融，子宫内受精卵暴露，体式显微镜下观察，统计受精卵数^[5]。

体外排受精卵速率：将L4期线虫挑到不同组别的培养皿中，各剂量组的线虫数目为10条，分别暴露24、48、72 h。在暴露即将结束时将线虫挑至新的种有OP50和纳米镍的NGM培养皿中，每个线虫一个NGM培养皿，3 h后，体式显微镜下观察，统计每个线虫排出体外的受精卵数量。

1.7 统计分析方法

数据采用SPSS 13.0软件处理，均用均数±标准差表示，单因素方差分析进行组间差异统计学分析。

2 结果

2.1 后代数目及世代时间测定结果

后代数目反映秀丽线虫的生殖能力。表1显示纳米镍对秀丽线虫后代数目的影响。结果表明，与对照组比较，纳米镍组的后代数目显著性降低。且后代数目的降低与纳米镍存在剂量依赖。抗氧化剂组的后代数目较纳米镍5.0 μg/cm²组又有回升趋势。与微米镍组比较，纳米镍5.0 μg/cm²组的后代数目显著性降低。世代时间反应秀丽线虫的生殖速度，秀丽线虫世代时间随纳米镍剂量增加而逐渐延长，抗氧化剂组的世代时间较纳米镍5.0 μg/cm²组略有减少。与对照组和微米镍组比较，纳米镍2.5 μg/cm²组和5.0 μg/cm²组的世代时间呈显著性增加。见表1。

表1 纳米镍对秀丽线虫后代数目和世代时间的影响（n=10，±s）

组别 (μg/cm2)	后代数目 （个）	世代时间 （h）
对照组	275.60±42.59	74.13±2.64
1.0	260.60±40.79#	75.47±3.77
2.5	255.30±33.43#	77.40±2.78#
5.0	213.00±40.27#1	78.69±5.53#1
抗氧化剂组	229.80±54.91*	77.27±4.39*
微米镍组	253.80±27.84#	73.09±1.83

注：#：与对照组比较，差异具显著性Plt;0.05

剩余内容已隐藏，请支付后下载全文，论文总字数：8234字