论文总字数：17221字

目 录

摘要 4

1.引言 6

1.1研究背景 6

1.2研究目的和意义 6

1.3 海洋微生物 6

1.3.1海洋细菌 7

1.3.2 海洋真菌 7

1.3.3其他 8

2.国内外研究现状 9

3.QPCR定量分析 9

3.1细菌16S rDNA 9

3.2 QPCR技术 10

4.材料和方法 10

4.1实验材料 10

4.2实验仪器 10

4.3采样时间 11

4.4 采样方法 11

4.5分析方法 11

4.5.1平板计数琼脂培养基的配置 11

4.5.2 细菌的培养和纯化 12

4.5.3 pH的测定 13

4.5.4拮抗菌的筛选 14

4.5.5 QPCR 14

5.结果与分析 15

5.1菌落培养 15

5.2 QPCR结果的分析 16

6.小结 17

7.展望 17

参考文献…………………………………………………………………18

致谢………………………………………………………………………20

海水养殖鱼类水体中微生物的初步分离及定量

冯先林

，China

Abstract：Microbial ecological environment in aquaculture water often depends on the microbial composition and abundance in water, which is an important indicator to measure the health of aquaculture water, their composition and abundance changes have a great impact on the health of aquaculture animals. In this paper, bacteria were extracted and purified from the water of healthy seawater aquaculture aquarium in Dachang dazzle aquarium, Pukou district, Nanjing city, and the dominant bacteria were quantitatively analyzed ( qpcr ) to judge the abundance of dominant bacteria, which laid the experimental foundation for the subsequent screening of bacterial preparations beneficial to aquaculture organisms and aquaculture environment. The results showed that the number of antagonistic bacteria in seawater was one order of magnitude higher than that in fresh water, and colony morphology was mainly circular. At the same time, compared with bacteria from xiyuan river water of Nanjing university of information technology, the results showed that there were more bacteria in seawater environment than in natural fresh water environment, and there were differences in composition. It shows that different water environment, due to the difference of water quality, leads to changes in microbial ecological composition. Therefore, different strategies need to be adopted when screening beneficial bacteria.

Key words：Aquarium;Seawater microorganisms; Separation; Quantitative analysis（QPCR）

1.引言

1.1研究背景

海洋是地球表面最为广阔的区域，覆盖了地球表面积的70%以上，迄今为止其中绝大部分区域还未获得真正意义上的开发。随着海洋技术的日益发展，各种与海洋息息相关的行业陆续兴起，海水养殖业便是其中之一。近年来，海水养殖业在我国沿海经济带快速发展，已逐渐成为我国沿海地区海洋经济的一个支柱性产业，但同时带来的各种弊端也逐渐暴露，如生态环境恶化、水质污染以及养殖病害严重等，它们严重地阻碍了海水养殖业的可持续发展。因此，世界各国对其健康养殖都非常重视，开展了大量长期的研究^[1] 。

1.2研究目的和意义

海水养殖业离不开微生物的微观调控与修复，有益微生物能使养殖生物机体健康，而有害微生物则会危及养殖生物，若人们能够好好地利用海洋微生物，则能够使海水养殖业创造出巨大的经济效益。海洋微生物在人们的日常生活中有许多积极作用，尤其是那些生存在海洋中某些特殊环境下的微生物，更是潜在的生物资源宝库，对人类社会的发展具有重大的战略意义，因此使得环境微生物的研究成为生命科学领域的热点话题。

本文对采自南京市浦口区大厂炫彩水族馆海水养殖水族箱中的水体进行了细菌的提取和纯化，并对其中的优势细菌进行了定量分析，以判断其中的优势菌群。目的是通过对养殖鱼类水体环境中细菌组成和丰度的分析，了解健康水体环境中的微生态环境，为后续筛选有益于鱼体生长的微生物制剂提供实验基础和理论参考。同时，还与采自南京市浦口区大厂炫彩水族馆淡水养殖水族箱及西苑的淡水水体细菌进行了对比，用以比较淡、咸水环境下细菌的组成、数量是否存在差异。

1.3 海洋微生物

海洋中生存着难以计数、分布广泛的海洋生物及微生物，后者不仅存在于海水、海泥和海砂中，甚至在鱼、虾、多毛类生物的组织、消化道中也都可以检测到。与大型海洋生物相比，微生物分布更为广泛，适应力更强，尤其是适应极端环境的能力，如：嗜盐性、嗜压性、嗜冷性、低营养性、趋化性、多形性和发光性等。因此，在它们体内必然具有与其适应力相联系的某些遗传、生理上的特质。当今社会，人们对资源的利用和开发能力日益提升，因而把目光投向了广袤的海洋，希望可以从中获得陆地上稀缺的有益资源，包括微生物资源。海洋微生物可分为海洋真菌、海洋细菌和病毒三大类。它们的生理、生化机能具有差异性，提取、纯化等分析方法也不相同。对于海洋生物来说，海水环境中的微生物分为有益微生物和有害微生物两种。海水养殖环境中的微生物种群数量处在动态的变化之中，其中有益微生物种群较多时，海水中的养殖产物就处于一种健康的状态，这对养殖生物乃至周围的环境都是非常有利的；相反，若是海水养殖环境中的有益微生物减少，有害微生物急剧增加的话，就容易导致养殖生物患病，严重时甚至会导致养殖生物死亡，这对培养的生物体和周围环境的健康非常不利。有益微生物使养殖生物处于稳定状态，保证其健康生长，而有害微生物则会导致养殖生物患病。TORANZO A E^[2]等发现弧菌、巴斯德菌、气单胞菌、假单胞菌属等革兰氏阴性菌以及肠球菌、链球菌、分支杆属等革兰氏阳性菌会引起海水养殖鱼类患病或死亡。病原微生物与养殖生物共同生活在一个环境中，它们既是相对的又是统一的，当养殖环境恶化时，环境中的病原微生物就会增多，导致养殖生物的机体免疫力下降，此时便会引发疾病。陶诗^[3]等经过观察发现，海水养殖产物中虾类的红腿病、甲壳溃疡以及烂鳃病等细菌性疾病就是由弧菌、气单胞菌、假单胞菌、螺菌、黄杆菌属等菌种引起的，而革兰氏阴性菌中的弧菌则是引起海水养殖产物中贝类细菌性疾病的主要病菌，弧菌能引起牡蛎细菌性溃疡，能使鲍鱼患上细菌性脓包病，还能导致文蛤和扇贝发病。

1.3.1海洋细菌

海洋细菌是广泛分布于海洋中的原核单细胞生物，其形态为球形、棒状、螺旋状和分枝状。苏晨阳^[4]等发现并筛选了海水中多种有益于水产动物生长的细菌，主要有光合细菌、芽孢杆菌、硝化细菌、蛭弧菌和放线菌等。在水产养殖中，光合细菌参与水中无用有机物的降解并吸收水体中的有害物质,从而起到净化水质的作用，使养殖生物处于健康的生存状态。另外，光合细菌中还含有可以促进鱼类消化吸收的酶，可以大大地提高饲料的利用率，节约养殖成本。芽孢杆菌具有繁殖快速、生命力强、体积大的特性和保湿性强、有机质分解能力强、抑菌灭害能力强、除臭的功能，它们可用于畜牧水产饲料添加剂和净化养殖环境。硝化细菌可以控制养殖池水体中的自生氨浓度，抑制其他不利于鱼类生长的藻类生物的繁殖。蛭弧菌可以用于清除水体中的有害细菌，在一定程度上为养殖生物的健康生长提供了保障。放线菌则可以产生酶、纤维素、维生素与有机酸等有用物质，这些物质可以清除海水环境中的有害杂草和寄生虫。而其他的一些有益细菌比如乳酸菌、双歧杆菌、球菌酵母菌等则可以作为养殖水体的水质调控剂，它们能够修复水体环境使之得到明显的改善。除此之外，海洋细菌还参与海洋中的氧化、还原活动以及氮循环、硫循环、磷循环等，维持和调整海洋生态系统的动态平衡。

1.3.2 海洋真菌

海洋真菌大多栖息于海洋中的寄主身上，哪里有寄主，哪里就有它们的踪迹。它们是具有真核结构的微生物，能够在海水中繁殖和生活。海洋真菌大多以分解者的角色存在，它们能够分解海水中的无机物，并且使无机营养盐再生。海洋真菌可以分成木生真菌、寄生藻体真菌、红树林真菌、海草真菌和寄生动物体真菌5种基本的类型。木生真菌在海洋中数量极多而且分布广泛，它们营腐生生活并且能够分解纤维素，可以清除死亡鱼类的尸体，净化水质。寄生藻体真菌有三种生存类型：腐生、寄生和共生，它们能够消除养殖水体中死亡鱼类的尸体，给养殖生物提供一个健康的生存环境。红树林真菌超过一半以上都是营腐生生活的，也能清除海水中死亡鱼类的尸体，净化水质。同时有些海洋真菌还是致病菌，能引起海洋动物致病，严重时甚至死亡，若人们能够充分有效地利用有益真菌，则海水养殖业能够减少大量的经济损失。

1.3.3其他

除此之外，海水养殖环境中还有和养殖鱼类共附生的微生物群落，它们多存在于鱼类的体表或体内，与鱼类同生共灭。冯敬宾^[5]等经过研究发现，在鱼类的鳃、皮肤和肠道内常存在大量的共附生细菌群落。通常情况下，共附生细菌群落对健康海水鱼类发挥的是有益的作用，这些积极有益的作用包括参与食物消化吸收、促生长、抗感染和免疫调节等等。多数海洋微生物是海洋环境中的分解者，它们能促进海洋环境中的物质循环和能量流通。有一部分海洋微生物还是生产者，它们促进海洋中的光合作用，给海水养殖生物提供了必要的生存条件。虽然养殖海域表面看起来一般都是风平浪静的，但实则水面下的养殖生物一直处在剧烈的运动之中，长久之后，水体环境就会变得越来越糟糕，逐渐不适合养殖生物生存，这时具有调控与修复海水养殖环境作用的海洋微生物就会发挥它们的作用，对水体进行修复。孟霞^[6]等通过大量实验，分析了微生物在海水养殖环境中的调控与修复作用，发现有益微生物对海水养殖环境的修复功能主要有去碳、去氮、解磷、硝化、反硝化、固氮、絮凝和去除淤泥等。海洋微生物个体微小，看似微不足道，实则却在海洋环境中发挥着至关重要的作用，例如：赤潮的微生物防治、抑藻基因的高效筛选、化感物质抑藻、提高海域生物的生产力和修复海洋污染等。赤潮的发展史也与海洋微生物有极大的关联^[7-9]，在赤潮发生的过程中，细菌为浮游生物提供营养盐（无机N、无机P、Fe、Mn等），在赤潮消亡的过程中，细菌通过细胞外分泌物和特殊的胞外酶杀死藻类。目前有些陆源药物无法量产，究其原因，并不是技术不成熟，而是没有药物材料来源。经过不懈努力，科学家们已经研究出了一些用于治疗癌症的药物，而这些用于生产治癌药物的材料正是来源于海洋微生物，若人们能够充分地将海洋微生物用于医疗事业，这对全人类来说都是一个福祉。近年来，黄渤海海域常出现赤潮和浒苔，持续时间日益增加，范围逐渐增大，给沿岸环境造成了严重影响，而海洋微生物中存在大量的分解者，如能有效地分离出这些菌种，利用这些海洋微生物来治理赤潮和浒苔，海水环境将得到大大的改善。海洋上游轮漏油事件的频繁发生，导致原油泄漏至海水之中，且极易扩散，不仅致使大量海洋生物缺氧死亡，还造成海洋大面积污染，而海洋微生物中以石油为营养物质的分解者可以有效、持久地抑制石油的扩散，治理海洋石油污染，并且不会带来新的污染源。

2.国内外研究现状

海洋是一个与陆地完全不同的生态环境。陆地环境中充满了氧气与光照，而海洋环境正好与之相反，缺少氧气与光照，它包括了高盐、高压、低温（特别是深海）、弱光和贫营养的特征。海洋环境处于快速的变化之中，生活在其中的海洋微生物也具有了与之相适应的多样性的特点。这些具有多样性的海洋微生物对人类来说是一笔巨大的财富，不仅在海水养殖方面为人类提供食品等资源，还为人们提供了更多的可以改善环境、提取药物、理论研究的基础和来源。因此，海洋微生物的研究，一向是海洋学家研究的热点领域。韩笑^[10]等发现在海岸湿地红树林中的海洋微生物能够产生纤维素酶，这些纤维素酶包括低温纤维素酶、碱性纤维素酶、耐热纤维素酶和耐盐纤维素酶等，在人们日常生活中的许多领域发挥着重要的作用，比如：生产洗涤剂、酱油酿造、果蔬加工、啤酒糖化等。尹慢慢^[11]等经过研究发现，海洋微生物的代谢产物具有抗菌作用，这些抗菌作用表现在：影响细菌的形态结构、影响细菌的疏水性、影响细菌的通透性等，这一发现，为海洋微生物的药物研究奠定了基础。乔苗^[12]等发现了海洋微生物具有活性，这些活性有抗肿瘤活性、抗菌活性、保健功能、抗病毒活性、杀虫活性以及降解石油的活性等，这些重大发现，为我国研发海洋微生物自主知识产权提供了必要性。 经过多方考察和研究，吕雪鑫^[13]等发现，海洋微生物在防治农作物病虫害方面具有积极的作用，海洋微生物能防治水稻病虫害、小麦病虫害、玉米病虫害、蔬菜病虫害、果树病虫害和其他农作物病虫害等，这些发现为人们研究生物农药提供了新思路。Grein^[14]等调查了海水中的放线菌，发现这些放线菌对革兰氏有抑菌作用。Krasil^[15]等报道了全世界海域中各种深度的326种细菌，发现其中有三分之一的菌种对一些病原细菌有抑制功效。郝亚南^[16-19]等经过多年的研究跟进，报道了海洋微生物在环境污染与治理方面的多种应用进展：1）治理赤潮 2）治理石油污染 3）降解有机磷农药 4）勘察天然水合物 5）勘查油气 6）生物农药方面。日本的Takahashi^[20]等从200株海洋放线菌中分离出了具有很强的杀螨虫活性物质Streptomycessioyaensis，人们利用这种物质产生的生物碱治理了大量的螨虫灾害。Xiong L^[21]等从海洋中分离出了170多株海洋链霉菌，海洋链霉菌的代谢产物具有很强的杀虫活性，特别是杀棉铃虫的活性。Zhang M^[22]等经过研究发现，海洋真菌的次级代谢产物具有抗菌作用，科学家们根据其抗菌机制研究出了不同效果的抗生素，有效地抑制了细菌的生长。Namikoshi^[23]等从海洋真菌中分离得到一种酯类化合物，这种化合物对癌细胞有抑制作用。

3.QPCR定量分析

3.1细菌16S rDNA

16S rDNA全称为16S ribosomal DNA，它是细菌中的一种DNA序列，用以编码相对应的核糖体RNA，所有细菌的基因组中都有16S rDNA。16S rDNA中的“S”表示沉降系数，它是生物大分子在离心场中向下沉降速率的一个指标，其值越高，说明分子越大。16S rDNA具有高度的保守性和特异性，它有很长的基因序列，其中包含了大概50个功能域，储存了大量基因信息。随着PCR技术的出现及核酸研究技术的不断完善，16S rDNA基因检测技术已成为检测和鉴定细菌的一种强有力的工具。随着数据库的不断完善，应用16S rDNA技术可以实现对细菌进行快速、微量、准确、简便地分类鉴定和检测。该技术主要有三个步骤：1、获取待测细菌的基因组DNA 2、获得该细菌的16S rDNA基因片段 3、分析该细菌的16S rDNA基因序列。16S rDNA对于细菌来说具有很多重要的功能，包括固定核糖体蛋白、与mRNA的起始密码子结合、结合两个核糖体子单元、稳定密码子以及和反密码子的正确配对等。

3.2 QPCR技术

QPCR的全称为Real-time Quantitative PCR Detecting System，这是一种实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统。QPCR的原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，从而得到一条荧光扩增曲线，最后通过Ct值和标准曲线对未知模板进行定量分析。QPCR的检测方法有SYBRGreen法和TaqMan法，两种检测方法所使用的荧光物质分别为荧光染料和荧光探针。QPCR已经发展到了第三代产品，其中第一代产品构成PCR定性检测，第二代产品构成PCR-DNA终点法定量检测，第三代产品构成QPCR-DNA/RNA实时荧光定量检测。QPCR具有所用仪器少、检测时间短、操作简单、结果精确等特点。实时荧光定量PCR技术的应用有基因表达分析、MicroRNA 与非编码 RNA 分析、SNP 基因分型分析、拷贝数变异 (CNV)分析、药物代谢酶（DME）基因分型分析、竞争性等位基因特异性分析（稀有突变检测）等。

4.材料和方法

4.1实验材料

海水样本（来源于南京市浦口区大厂炫彩水族馆）、淡水样本（来源于南京市浦口区大厂炫彩水族馆淡水养殖水族箱及西苑河流）

4.2实验仪器

电子天平、琼脂、培养瓶、pH计、温度计、塑料烧杯、细菌培养基、接种环、酒精灯、涂布棒、高温灭菌箱、紫外灭菌箱、恒温培养箱、蒸馏水、玻璃棒、记号笔等。

4.3采样时间

2018年4月1日

4.4 采样方法

采用10mL无菌血清瓶保存样品。在南京市浦口区大厂炫彩水族馆淡水养殖水族箱及西苑，选择鱼类生长健康、活力充沛的水体环境，用胶头滴管分别从不同的水族箱中采取水样至无菌血清瓶中。密封完好，并用记号笔在无菌血清瓶的瓶身写上样本的种类和编号。保存在4℃冰箱中至测定开始。

4.5分析方法

4.5.1平板计数琼脂培养基的配置

本次实验采用平板计数琼脂进行细菌的提取和纯化工作，其配制比例为：胰蛋白胨5.0g， 酵母浸粉2.5g， 葡萄糖1.0g琼脂15.0g 蒸馏水1000ml pH：6.8-7.2。 

首先检查所用物品的规格和洁净程度，然后戴上实验室专用手套，打开电子天平，在天平上放一张称量纸，调零，小心称取琼脂23.5g，将琼脂倒进烧杯中，再逐渐添加蒸馏水，用玻璃棒搅拌，定容至1000ml。接着进行分装，将1000ml琼脂营养液均匀地分装至5个培养瓶中，每个200ml。将培养瓶的瓶盖轻轻放在瓶上即可，加热煮沸至全部溶解，然后将培养瓶放入高温灭菌箱中，在121℃温度下灭菌15分钟（图1）。将高温灭菌后的琼脂培养液小心地倒入平板培养基中，使其均匀的覆盖住整个平板，然后将倒好的平板培养基整齐的排列在紫外灭菌箱中，紫外线灭菌24h（图2）。

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